楊麗萍，蒙子寧，劉曉春，張 勇，黃俊海，黃 景，林浩然, 4

(1.中山大學水生經濟動物研究所∥廣東省水生經濟動物良種繁育重點實驗室，廣東 廣州 510275；2. 西南林業(yè)大學云南省森林災害預警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224；3. 珠海金鯢野生動物養(yǎng)殖有限公司，廣東 珠海 519015；4. 海南大學海洋學院, 海南 ?？?570228)

中國大鯢Andriasdavidianus隸屬于兩棲綱Amphibia，有尾目Caudata，隱鰓鯢科Cryptobrachidae，大鯢屬Andrias，是中國特有的珍稀瀕危物種，廣泛分布于長江、黃河及珠江中下游支流中，遍及華中、華南和西南等17個省區(qū)[5]。中國大鯢具有終身水棲的生理特性，因而難以越過陸地遷徙，其遺傳分化很可能與流域分布相關聯(lián)。然而，近期報道卻顯示二者之間關聯(lián)性不強[6-8]。這些研究主要使用了線粒體編碼基因序列和同工酶方法，所分析的樣品總數在13-28尾。樣品數目偏少很可能無法反應物種真實的遺傳結構，因此有必要采用新方法，擴大樣品量進一步進行中國大鯢遺傳分化與系統(tǒng)地理學的研究。

新型分子標記AFLP，融合了RFLP的可重復性和RAPD的簡便性，具有信息量大、靈敏度高、多態(tài)性豐富和重復性好等優(yōu)點[9]。早期AFLP分析主要應用于植物領域[10]，隨后逐步拓展到動物領域，目前已廣泛應用于黑真螈Salamandraatra、日本大鯢A.japonicus和草莓箭毒蛙Dendrobatespumilio等兩棲類遺傳結構分析及保護遺傳學研究[11-13]。

本研究擬利用AFLP技術進一步分析中國大鯢五個地理種群遺傳多樣性和遺傳分化，并聯(lián)系相關歷史地理事件，對中國大鯢種群的遺傳結構特點及其歷史成因進行探討，旨在獲得中國大鯢種群的遺傳多樣性資料，以及遺傳分化與環(huán)境間的相互關系，為合理利用大鯢種質資源提供遺傳背景資料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及DNA提取

中國大鯢各地理種群樣品由珠海斗門金鯢水產科技有限公司在各原產地獲得，采樣地及所屬流域見表1和圖1，包括5個種群共60個個體。剪取尾部少量肌肉組織，置于液氮保存，運回實驗室后放入-80 ℃超低溫冰柜備用。

取出保存?zhèn)溆玫拇篥F肌肉樣品，剪取約50 mg組織，采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取基因組DNA。w=0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，Eppendorf分光光度計測定DNA純度與濃度。

1.2 AFLP擴增及數據分析

AFLP擴增參照Vos等[14]所報道的方法并做略微改動?；蚪MDNA用EcoRI和MseI 37 ℃雙酶切10 h，加入接頭混合物后于22 ℃過夜。用帶有1個選擇性堿基的引物(E-A，M-C)進行預擴增。少量預擴增產物用于電泳檢測，剩余樣品經滅菌水稀釋10倍后作為選擇性擴增模板。使用帶有3個選擇性堿基的引物進行選擇性擴増。擴增產物經w=4.5% 變性聚丙稀酰胺凝膠分離后，通過銀染法顯帶。以擴增條帶數目適中、分布均一和多態(tài)性高為標準，從96對引物組合中篩選出9對引物組合(E-AAC/M-CGT、E-ACA/M-CAC、E-ACT/M-CGA、E-ATC/M-CGA、E-ATC/M-CTT、E-ATG/M-CGT、E-ATG/M-CGA、E-ACA/M-CGA和E-AGA/M-CGA)用于本研究。AFLP操作流程中所用藥品均購自上海生工生物工程技術服務有限公司(Shanghai Sangon)，PCR儀為PTC-200擴增儀(Bio-RAD)。

1.3 數據分析

電泳圖譜中的每條DNA譜帶記為一個位點，只記錄電泳后可辨認的條帶。當某一擴增帶出現時記為1，缺失記為0，從而建立原始譜帶矩陣。

利用種群遺傳學軟件POPGENE1.32對“1/0” 矩陣進行處理，統(tǒng)計多態(tài)位點百分率、基因多樣性和香農信息指數等遺傳參數，評估中國大鯢五個地理種群的遺傳多樣性水平。

通過WINAMOVA v 1.55軟件，依據AMOVA(analysis of molecular variance)方法計算居群內和居群間的遺傳變異、Fst類似物Phist(Фst)和遺傳距離。通過MEGA 3.1軟件對種群間遺傳距離構建UPGMA系統(tǒng)進化樹。

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表1 采樣點及樣本信息

圖1 中國大鯢種群樣品的采樣地(黑色圓點表示)

2 結 果

2.1 遺傳多樣性

9對引物在中國大鯢5個種群60個樣品中共檢測到507個位點，其中多態(tài)位點數為354個，多態(tài)位點比例為69.82%，片段大小在100～1 300 bp之間。圖2列舉了E-ATG/M-CGA引物組合對各地理種群進行AFLP擴增的電泳圖結果。中國大鯢5個種群總的多態(tài)位點比例、香農信息指數和基因多樣性指數分別為69.82%，0.362 9和0.241 4。其中5個地理種群的多態(tài)位點比例呈貴州>陜西>河南>四川>湖北的遞減(見表2)。貴州種群的香農信息指數和基因多樣性指數最高，分別為0.281 1±0.013 8和0.194 6±0.009 7；湖北種群的香農信息指數(0.226 6±0.013 3)和基因多樣性指數(0.156 3±0.009 3)最低，其變化趨勢與多態(tài)位點比例相同(見表2)。

圖2 引物組合E-ATG/M-CGA對中國大鯢5個種群AFLP擴增的部分帶譜

表2 中國大鯢5個野生種群多態(tài)位點比例、香農信息指數和基因多樣性指數

Table 2 Percent of polymorphic loci, Shannon information index and gene diversity within five nature populations ofA.davidianus

種群多態(tài)位點比例香農信息指數基因多樣性指數河南 41.22%0.243 8±0.013 50.168 2±0.009 5四川40.63%0.245 7±0.013 50.170 0±0.009 5陜西 44.38%0.261 4±0.013 60.180 1±0.009 5湖北 37.67%0.226 6±0.013 30.156 3±0.009 3貴州 46.94%0.281 1±0.013 80.194 6±0.009 7總計 69.82%0.362 90.241 4

2.2 遺傳分化與遺傳距離

通過AMOVA方法對各種群遺傳變異進行了分析，結果顯示，有97.94%的變異存在于種群內，僅有2.06%的變異存在于種群間。AMOVA分析得到遺傳分化參數Фst 為 0.021(P<0.001)，顯示種群間遺傳分化較小。

種群間的遺傳距離分布于0.004 6～0.040 8(表3)。其中，貴州與四川種群之間遺傳距離最小，為0.004 6，而湖北與河南種群之間遺傳距離最大，達到0.040 8。

采用種群間遺傳距離構建了UPGMA樹(見圖3)。系統(tǒng)樹主要分為兩大支，一支由黃河流域河南種群組成；另一支由長江流域四川、貴州、湖北和陜西種群組成，其中屬于長江中游段重要支流漢江水系的陜西和湖北兩個種群聚類，屬于長江上游段的四川種群和貴州種群聚類。基本依照流域進行聚類。系統(tǒng)進化樹中最早分出的是位于中國北部的河南種群；地處中國中部的湖北和陜西種群先于位于南部的貴州和四川種群分出。進化地位的古老性關系體現為北部>中部>南部。

表3 中國大鯢5個野生種群間遺傳距離

圖3 基于種群間遺傳距離構建的UPGMA樹

3 討 論

3.1 中國大鯢野生種群遺傳多樣性分析

從進化觀點來看，中國大鯢是由3億6千萬年前古生代泥盆紀時期水生魚類演變而成的古老兩棲動物，對探討脊椎動物由水生到陸生的演變具有關鍵性的意義。為闡明中國大鯢的遺傳背景，本研究將中國大鯢與其近緣物種以及進化歷程相近的物種進行了遺傳多樣性的比較。

本研究AFLP分析得到的中國大鯢種群多態(tài)位點比例(P)為69.82%，基因多樣性指數(H)為0.241 4。中國大鯢的遺傳多樣性高于施氏巴鯢Liuashihi(H：0.154 0)[16]，但低于俄勒岡陸巨螈(H：0.309 4)和赤背蠑螈(H：0.246 0)[3-4]。上述兩種鯢類基因多樣性低于兩種蠑螈類相應遺傳參數，從棲息生境來看，所比較的兩種鯢類為終身水棲，而兩種蠑螈類均為成體陸棲。Nevo等[17]在對兩棲類進行等位酶分析時發(fā)現，陸棲生物相比水棲生物具有更高的遺傳多樣性，這與陸棲生物具有相對較廣的生境寬度(niche breadth)和更高的生態(tài)穩(wěn)定性(ecological stability)等有關。此外，將中國大鯢與其進化歷程相近的一些古老物種進行比較，中國大鯢的遺傳多樣性均高于所比較的巴西蛇頸龜Hydromedusamaximiliani(P：37.00%)[18]、北美食鼠蛇Elapheobsoleta(P：35.00%)和揚子鱷Alligatorsinensis(P：58.50%)[19-20]。遺傳多樣性參數均揭示中國大鯢遺傳多樣性較為豐富，這與其生活史特征及地理分布相一致。中國大鯢一般3～5齡性成熟，生活史長達100多年，較大的年齡結構差異容易維持較高的遺傳多樣性水平[21]。此外，中國大鯢分布區(qū)域遍及中國17個省區(qū)，在暖溫帶、亞熱帶不同氣候條件下均有分布。分布區(qū)域較廣也是其遺傳多樣性較高的一個原因。遺傳多樣性是物種長期進化的產物，與物種適應能力、生存能力和進化潛力密切相關。由此可見中國大鯢這一古老物種能夠歷經幾億年自然環(huán)境和氣候的變化存活至今，與其具有較高的遺傳多樣性有一定的關系。

中國大鯢5個地理種群的多態(tài)位點比例由高到低依次為貴州(46.94%)>陜西(44.38%)>河南(41.22%)>四川(40.63%)>湖北(37.67%)。大鯢在上述5個取樣地均呈現集中分布。陜西省太白縣湑水河設立有國家級中國大鯢自然保護區(qū)，地理位置處于漢江上游，位于陜西漢中之上。貴州龍里所處的烏江水系上游也設有中國大鯢自然保護區(qū)。河南盧氏縣建有省級中國大鯢自然保護區(qū)。貴州、陜西和河南種群遺傳多樣性相對較高，可能與自然保護區(qū)對中國大鯢野生種群的保護效果較好有關。

大鯢的人工養(yǎng)殖于20世紀70年代開始在各地廣泛開展。養(yǎng)殖基地親本多來自野生種群，養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，可能會影響到野生種群遺傳結構。湖北省十堰市房縣建有馴養(yǎng)規(guī)模在萬尾以上的中國大鯢養(yǎng)殖基地，為建立親本群體，當地野生種群可能經歷過一次瓶頸效應，造成遺傳多樣性水平較低。而在同樣建有大規(guī)模養(yǎng)殖基地的陜西省漢中，中國大鯢遺傳多樣性仍然維持在較高水平，這可能與當地野生種群遺傳多樣性自身水平較高有關。

3.2 遺傳結構及種群分化

中國三大水系的發(fā)育形成具有上億年的歷史，其中長江與“黃河”分隔較早，在中生代侏羅紀末至白堊紀初，秦嶺山脈的上升，切斷長江與北方的聯(lián)系，經歷燕山運動后期后，長江全貌顯現[22]。長江與珠江的分離是在白堊紀末、第三紀初燕山運動之南嶺期時成形[23]。黃河的形成時期最晚，在新生代第四紀，由于喜馬拉雅運動，西部青藏高原地勢升高，原有的湖泊相連而成。盡管黃河形成比較晚，但早期已經出現大量湖泊溪流[24]。遷徙力較差的古老物種在經歷地理分隔事件后，物種群體間基因流被阻斷，隨著時間的積累而產生種內差異，地理格局往往可以反映其遺傳關系。本研究中國大鯢種群的聚類情況大致依照所屬流域進行，體現了與地理分布格局的統(tǒng)一性。種群聚類分析顯示中國大鯢依照長江流域和黃河流域分為兩大支。其中長江流域中屬于長江中游段重要支流漢江水系的陜西和湖北兩個種群聚類，屬于長江上游段的四川種群和貴州種群聚類。然而來自線粒體與同工酶方法的結果卻未得到聚類與流域一致[6-8]。Murphy等[6]采用線粒體與同工酶技術分析中國大鯢遺傳多樣性所用樣品量為18尾，陶峰勇等[7-8]利用Cyt b和控制區(qū)序列分析時分別用到13尾和28尾。而本研究樣品量達到60尾。樣品量多少可能會影響到種群間遺傳距離與聚類分析。此外，分析方法的差異可能會影響到結果，同工酶方法檢測的多態(tài)位點數目有限，相比而言AFLP標記可獲得豐富的多態(tài)位點。

AFLP分析得到的遺傳分化指數Фst僅為0.021，顯示分化較低。種群間AMOVA遺傳變異分析也顯示，在眾多變異中有97.94%存在于種群內，僅有2.06%變異存在于種群間。遺傳距離結果也顯示中國大鯢不同地理種群間遺傳差異較小。中國大鯢自身遷徙力很差，除在自身流域內活動外，在各流域之間遷徙較難，那么為什么中國大鯢種群間的遺傳分化如此小呢？分析中國大鯢的使用歷史，可以得出人為操作是主要誘因。對中國大鯢食用與藥用價值的認識最早始于戰(zhàn)國時期，距今有近2 300 a歷史，在相互交流中可能有中國大鯢的移動發(fā)生。但由于古代交通閉塞，這種人為影響作用相對較弱。在20世紀50年代到80年代，人們對中國大鯢進行了大規(guī)模捕殺販賣，其中存在個別個體在非原產地逃逸的現象；另外，對于被查獲而沒收的中國大鯢活體，國家相關管理部門通常采用就近放流，此操作直接將其它地理種群引入當地野生群體，造成極強的基因流效應。此外，人工放流也是降低種群分化的一個重要原因。人工養(yǎng)殖鯢苗的親本往往來自于全國各主要產區(qū)的野生個體，放流操作一方面使得野外群體數量短期得到大量增加，另一方面也嚴重破壞了當地原有種群的遺傳結構。在2002-2009年期間，中國大鯢各原產地先后組織了多次大規(guī)模的人工放流。

依據種群間遺傳距離構建的UPGMA樹得出位于中國北部的黃河流域群體處于樹的基部，顯示北部群體具有較為古老的進化地位。其次分出的是位于中部的湖北、陜西種群，最后為南部貴州及四川種群。提示中國大鯢北部種群更為原始，其次為中部和南部種群?；诖送茰y，中國大鯢首先到達中國北部，并由此進一步向中部及南部地區(qū)進行擴散(圖4)，即由河南→陜西、湖北→四川、貴州。這一推測得到了化石證據的進一步支持。最早的現生蠑螈類化石發(fā)現于中國內蒙古及河北地區(qū)，地質年代為侏羅紀中期，其骨骼結構以及形態(tài)發(fā)育與隱鰓鯢科相似性極高[25-26]。黃河流域是離中國內蒙古及河北地區(qū)最近的區(qū)域，因而應該是中國大鯢最先到達的地域，進而由此擴散到中南部地區(qū)。

圖4 推測中國大鯢擴散途徑示意圖

中國大陸黑斑側褶蛙的擴散途徑與本研究得出的中國大鯢的擴散途徑一致，即由北向南進行擴散[27]，而楊玉慧等對中國黑斑蛙分析得出了由南至北的擴散方式[28]。歷史上冰期與間冰期旋回引起的氣候波動及生境變化會影響到物種分布與擴散。第四紀冰期對北美洲和歐洲影響較大，當地冰期后物種普遍呈現由南向北的擴散模式[29-30]。東亞由于受到青藏高原隆起及季風氣候的影響，冰川發(fā)育程度和面積要比北美與歐洲弱。在冰期影響不嚴重的地域，不同物種由于自身生境條件、繁殖能力與擴散能力的不同，其擴散途徑可能存在差異。

參考文獻：

[1]AMATO M L, BROOKS R J, FU J. A phylogeographic analysis of populations of the wood turtle (Glyptemysinsculpta) throughout its range [J]. Mol Ecol, 2008, 17: 570-581.

[2]RISSLER L J, HIJMANS R J, GRAHAM C H, et al. Phylogeographic lineages and species comparisons in conservation analyses: a case study of California herpetofauna [J]. Am Nat, 2006, 167: 655-666.

[3]GIBBS J P. Genetic structure of redback salamanderPlethodoncinereuspopulations in continuous and fragmented forests [J]. Biol Conserv, 1998, 86: 77-81.

[4]CURTIS J M R, TAYLOR E B. The genetic structure of coastal giant salamanders (Dicamptodontenebrosus) in a managed forest [J]. Biol Conserv, 2004, 115: 45-54.

[5]葉昌嬡, 費梁, 胡淑琴. 中國珍稀及經濟兩棲動物[M]. 成都: 四川科學技術出版社, 1993: 64-69.

[6]MURPHY R W, FU J Z, UPTON D E, et al. Genetic variability among endangered Chinese giant salamander,Andriasdavidianus [J]. Mol Ecol, 2000, 9: 1539-1547.

[7]陶峰勇, 王小明, 鄭合勛, 等. 中國大鯢四群體的遺傳結構和地理分化[J]. 動物學研究, 2005, 26: 162-167.

[8]陶峰勇, 王小明, 鄭合勛. 中國大鯢五地理群體Cyt b 基因全序列及其遺傳關系分析[J]. 水生生物學報, 2006, 30(5): 625-627.

[9]陳省平, 胡曉麗, 劉濤. 赤點石斑魚7個地理群體的AFLP分析[J]. 中山大學學報:自然科學版, 2009, 48(1): 56-61.

[10]王崢峰, 張軍麗. 厚殼桂種群在不同群落中的AFLP分析[J]. 中山大學學報: 自然科學版, 2000, 39(4): 125-127.

[11]RIBERON A, MIAUD C, GUYETANT R, et al. Genetic variation in an endemic salamander,Salamandraatra, using amplified fragment length polymorphism [J]. Mol Phylogenet Evol, 2004, 31: 910-914.

[12]MATSUI M, TOMINAGA A. A survey by AFLP of genetic diversity in the Japanese giant salamander aiming conservation of local populations [J]. Ecol Civil Eng, 2007, 10(2): 175-184.

[13]RUDH A, ROGELL B, H?GLUND J. Non-gradual variation in colour morphs of the strawberry poison frogDendrobatespumilio: genetic and geographical isolation suggest a role for selection in maintaining polymorphism. Mol Ecol, 2007, 16 (20): 4284-4294.

[14]VOS P, HOGERS R, BLEEKER M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting [J]. Nucleic Acids Res, 1995, 23: 4407-4414.

[15]章克家, 王小明. 吳巍, 等. 大鯢保護生物學及其研究進展[J]. 生物多樣性, 2002, 10(3): 291-297.

[16]胡佳磊, 邵雪玲, 劉思陽. RAPD引物數量對施式巴鯢遺傳多樣性評估結果的影響[J]. 氨基酸和生物資源, 2005, 27(1): 27-31.

[17]NEVO E, BEILES A. Genetic diversity and ecological heterogeneity in amphibian evolution [J]. Copeia, 1991, 3: 565-592.

[18]SOUZA F L, CUNHA A F, OLIVERIRA M A, et al. Partitioning of molecular variation at local spatial scales in the vulnerable neotropical freshwater turtle,Hydromedusamaximiliani(Testudines, Chelidae): implications for the conservation of aquatic organisms in natural hierarchical systems [J]. Biol Conserv, 2002, 104: 119-126.

[19]PRIOR K A, GIBBS H L, WEATHERHEAD. Population genetic structure in the black rat snake: implication for management [J]. Conserv Biol, 1997, 11 (5): 1147-1158.

[20]WANG Y Q, ZHU W Q, HUANG L, et al. Genetic diversity of Chinese alligator (Alligatorsinensis) revealed by AFLP analysis: an implication on the management of captive conservation [J]. Biodivers Conserv, 2006, 15: 2945-2955.

[21]HAMRICK J L. Isozymes and the analysis of genetic structure in plant populations [M]. In: Soltis DE, Soltis PM (eds). Isozymes in plant biology. London: Chapman and Hall, 1990, 87-105.

[22]李承三. 長江發(fā)育史[J]. 人民長江, 1956(12): 3-6.

[23]翁文灝. 中國東部中生代以來之地殼運動及火山活動[J]. 中國地質學會志, 1927, 6 (1): 9-36.

[24]戴英生. 黃河的形成與發(fā)育簡史[J]. 人民黃河, 1983, 6: 2-7.

[25]GAO K Q, SHUBIN N H. Late Jurassic salamanders from northern China [J]. Nature, 2001, 410: 574-576.

[26]GAO K Q, SHUBIN N H. Earliest known crown-group salamanders [J]. Nature, 2003, 422: 424-428.

[27]張雄飛, 周開亞, 常青. 中國大陸黑斑側褶蛙基mtDNA控制區(qū)序列的種群遺傳結構[J]. 遺傳學報, 2004, 31(11): 1232-1240.

[28]楊玉慧, 張德興, 李義明, 等. 中國黑斑蛙種群的線粒體DNA多樣性和生物地理演化過程的初探[J]. 動物學報, 2004, 50(2): 193-201.

[29]HEWITT G M. Some genetic consequences of ice ages, and their role in divergence and speciation [J]. Biol J Linn Soc, 1996, 58: 247-276.

[30]HEWITT G M. The genetic legacy of the quaternary ice ages [J]. Nature, 2000, 405: 907-913.