王 燕，顏成龍，郭先偉，李新平，梁克勇，唐玲玲，黃麗蓉

（1.無錫江原安迪科分子核醫(yī)學(xué)研究發(fā)展有限公司，江蘇 無錫 214063；2.無錫市人民醫(yī)院，江蘇 無錫 214000）

順鉑（順氯氨鉑，cisplatin，DDP）自1978年首先在美國(guó)批準(zhǔn)臨床使用后，迅速成為臨床癌癥治療的佼佼者［1］。它主要通過破壞癌細(xì)胞的DNA復(fù)制而發(fā)揮作用，具有療效確切、抗癌譜廣、抗癌活性高等特點(diǎn)。研究表明，順鉑對(duì)腫瘤抑制率可達(dá)61%～98%［2］，因其還具有與多種抗腫瘤藥的協(xié)同作用，且無交叉耐藥等特點(diǎn)，為當(dāng)前聯(lián)合化療中最常用的藥物之一，尤其對(duì)于實(shí)體瘤和對(duì)一般化療不甚敏感的腫瘤療效較為顯著，如在肺癌治療方面，與VP－16聯(lián)合（EP方案）為治療SCLC或NSCLC的一線方案；聯(lián)合MMC、IFO（IMP方案），或 NVB等方案為目前治療NSCLC的常用方案。

1979 年 WHO（World Health Organization）確定了實(shí)體瘤雙徑測(cè)量的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。20多年來，由于WHO標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單、客觀、易行，已為世界各國(guó)普遍采用，對(duì)新藥臨床試驗(yàn)和不同單位之間療效比較有明顯的促進(jìn)作用［3］，但也存在不少問題。隨著醫(yī)學(xué)影像技術(shù)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，利用PET活體、早期評(píng)價(jià)藥物療效成為研究熱點(diǎn)。小動(dòng)物PET是基于PET臨床診斷技術(shù)發(fā)展起來的，可以利用正電子核素標(biāo)記示蹤分子進(jìn)行活體顯像，能夠無創(chuàng)、動(dòng)態(tài)、定量地從分子水平觀察活體的生理、生化變化特點(diǎn)，自20世紀(jì)90年代出現(xiàn)以來，已廣泛應(yīng)用于葡萄糖代謝研究、神經(jīng)受體系統(tǒng)研究、腫瘤學(xué)研究等［4－8］。在腫瘤藥物藥效研究方面，MicroPET可研究人類腫瘤的動(dòng)物模型，將瘤組織接種于動(dòng)物的四肢、背部和肩部等，這些部位的本底值遠(yuǎn)低于主要臟器，容易進(jìn)行精確定量分析。相對(duì)于傳統(tǒng)用卡尺測(cè)瘤徑，計(jì)算瘤體積，根據(jù)給藥前后瘤體積變化來評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物藥效的方法來說，消除了人為測(cè)量誤差，通過分子水平上的活體觀察可以更早、更精確地對(duì)抗腫瘤藥物的藥效進(jìn)行評(píng)價(jià)。

目前應(yīng)用最廣的示蹤劑是18F－FDG，但其主要反映體內(nèi)葡萄糖代謝情況，不能高特異性、高選擇性地檢測(cè)腫瘤［9］。18F－FLT是一種胸腺嘧啶類似物，可以間接反映腫瘤細(xì)胞的增殖情況［10］。本工作擬利用18F－FLT MicroPET 評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物順鉑的早期療效，并與傳統(tǒng)的通過測(cè)量瘤體積評(píng)價(jià)藥效的方法進(jìn)行比較，再結(jié)合病理切片實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以評(píng)價(jià)18F－FLT Micro PET在抗腫瘤藥早期藥效評(píng)價(jià)方面的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器與裝置

Sumitomo HM－7型醫(yī)用回旋加速器：日本住友重機(jī)械工業(yè)株式會(huì)社；PET－MF－2V－IT－I型氟多功能合成模塊：北京派特生物技術(shù)有限公司；Matrx VMR型麻醉機(jī)：美國(guó) MATRX公司；Micro－PET掃描儀：德國(guó)Inveon SIMENS公司；CURIEMENTOR 3型活度計(jì)：德國(guó)PTW公司；SEL－1型層流架：江蘇省蘇州市吳縣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施設(shè)備廠；Lunaire Model BI0620M 細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國(guó)Theron Foema公司。

1.2 主要材料與試劑

滅菌注射用水：江蘇四環(huán)生物股份有限公司；順鉑：山東魯抗藥業(yè)；RPMI1640培養(yǎng)液：GIBICOL產(chǎn)品；胰酶消化液：GIBICOL產(chǎn)品；小牛血清：中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司；18F－FLT：自制，放化純度＞95%；麻醉劑異氟烷：美國(guó)Minrad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB／c裸鼠：12只，雌雄各半，3～4周齡，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SCXK（滬）2007－0005，按SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心層流架內(nèi)。

非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞：中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液（含100mg／L青霉素，100mg／L鏈霉素）于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種針和注射針均為美國(guó)BD公司醫(yī)用5號(hào)針。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 A549腫瘤模型鼠的制作

取指數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化液消化后，用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107／mL。無菌條件下，每只裸鼠右邊腋下注射0.2mL細(xì)胞懸液（含2×106個(gè)細(xì)胞）。裸鼠繼續(xù)飼養(yǎng)于SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心層流架內(nèi)。接種后5～6周，瘤徑長(zhǎng)到5～7mm時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 模型鼠分組及給藥方式

12只模型鼠分為2組，一組為給順鉑藥物治療組（給藥組），一組為對(duì)照組，每組模型鼠雌雄各3只。給藥組給藥劑量為25mg／kg，對(duì)照組根據(jù)裸鼠體重，給予相當(dāng)量的賦形劑。灌胃給藥，每天一次。

2.3 MicroPET掃描法評(píng)價(jià)抗腫瘤藥藥效

模型鼠給藥前先進(jìn)行18F－FLT MicroPET掃描一次，給藥后第2、5、9和14d再行18F－FLT MicroPET掃描：取各組肺癌模型鼠稱重后，尾靜脈注射0.2mL（3.7MBq）18F－FLT，注射后45min，用異氟烷麻醉，將模型鼠平放于Micro－PET掃描床上，掃描采集10min，圖像用OSEM 3D法進(jìn)行重建。

2.4 傳統(tǒng)方法評(píng)價(jià)抗腫瘤藥藥效

每只模型鼠在18F－FLT MicroPET掃描前，均用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），利用公式V＝1／2×a×b2計(jì)算瘤體積。

2.5 病理組織學(xué)實(shí)驗(yàn)

通過對(duì)每次掃描的Micro PET數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在對(duì)照組和給藥組瘤組織攝取18F－FLT有顯著性差異的時(shí)候，每一組模型鼠選擇一只，將其瘤組織剝離，置入4%中性甲醛固定，石蠟包埋，組織切片行HE染色。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS 19.0進(jìn)行分析，組間采用F檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01為有顯著差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 18F－FLT MicroPET掃描結(jié)果

18F－FLT MicroPET掃描組織攝取情況列于表1。由表1可以看出，在給藥第2天，給藥組瘤 組 織 對(duì)18F－FLT 的 放 射 性 攝 取 平 均 為（3.87±0.61）%ID／g，比給藥前降低21.28%，到給藥第5天，瘤組織的放射性攝取降至最低，為（3.40±0.44）%ID／g，降幅為36.48%。而對(duì)照組第2天和第5天瘤組織的放射性攝取與給藥前相比，無明顯變化。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0分析，給藥第2d，給藥組與對(duì)照組之間已有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），F(xiàn)值為7.450；給藥第5d，給藥組與對(duì)照組之間有顯著性差異（P＜0.01），F(xiàn)值為17.961。

表 1 18F－FLT MicroPET掃描瘤組織攝取情況±s，n＝5）

表 1 18F－FLT MicroPET掃描瘤組織攝取情況±s，n＝5）

注：1）與對(duì)照組比P＜0.05；2）與對(duì)照組相比P＜0.01

放射性攝?。?ID·g－1）時(shí)間／天0 2 5 9 14對(duì)照組 4.86±0.84 5.01±0.83 4.82±0.69 5.22±0.75 5.32±0.80給藥組 4.91±0.71 3.87±0.611） 3.53±0.352） 3.71±0.452） 3.83±0.532）

同一只給藥組模型鼠不同給藥時(shí)間相同層面的18F－FLT MicroPET掃描圖示于圖1，從圖1可以看出，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)瘤組織18FFLT的濃聚程度不斷降低。

3.2 傳統(tǒng)方法評(píng)價(jià)抗腫瘤藥藥效結(jié)果

在各組模型鼠進(jìn)行MicroPET掃描實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，每只荷瘤鼠的瘤組織都用游標(biāo)卡尺測(cè)量其長(zhǎng)、短徑，并利用公式V＝1／2×a×b2計(jì)算瘤體積數(shù)值，結(jié)果見列于表2。各組瘤體積的數(shù)據(jù)，用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在給藥第9 d開始，給藥組和對(duì)照組才有顯著性差異（P＜0.01），F(xiàn)值為14.932。

表2 傳統(tǒng)方法測(cè)瘤體積數(shù)據(jù)（±s，n＝5）

表2 傳統(tǒng)方法測(cè)瘤體積數(shù)據(jù)（±s，n＝5）

注：1）與對(duì)照組相比P＜0.01

瘤體積／mm3給藥時(shí)間／d對(duì)照組 給藥組0 223.2±75.5 217.3±77.2 2 262.1±73.8 248.6±67.6 5 590.7±192.8 402.9±102.3 9 959.4±152.7 598.4±170.41）14 1 378.0±177.8 676.2±139.71）

3.3 病理組織學(xué)結(jié)果

從對(duì)照組和治療組各選一只小鼠進(jìn)行病理組織學(xué)實(shí)驗(yàn)：腫瘤HE染色后，低倍鏡下觀察，結(jié)果分別示于圖2和圖3。由圖2可以看出，對(duì)照組瘤細(xì)胞排列致密，細(xì)胞分裂增生旺盛，核異形明顯，細(xì)胞核染色較深，胞漿豐富；由圖3可見，給藥組瘤細(xì)胞排列松散，并呈現(xiàn)不同程度壞死。

圖2 對(duì)照組瘤組織病理切片

3.4 討 論

圖3 給藥組瘤組織病理切片

瘤徑測(cè)量的傳統(tǒng)療效評(píng)價(jià)方法結(jié)果顯示，在給藥第9d，給藥組和對(duì)照組瘤體積之間才有顯著性差異，而Micro PET掃描法在給藥第2d即觀察到，給藥組和對(duì)照組的瘤組織攝取18F－FLT的程度已出現(xiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。病理組織學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示在給藥第2d，與對(duì)照組相比，給藥組瘤組織已呈現(xiàn)不同程度壞死。上述結(jié)果提示，當(dāng)抗腫瘤藥物已開始有藥效作用時(shí)并不能立即通過實(shí)體瘤的體積的變化及時(shí)的反應(yīng)出來，Micro PET掃描方法則不然，它是通過檢測(cè)對(duì)瘤組織的分子水平上的變化來檢測(cè)抗腫瘤藥物的藥效作用，因此可以更早、更精準(zhǔn)地反應(yīng)出抗腫瘤藥物的早期藥效。病理組織學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證也表明，在給順鉑藥第2d，瘤組織HE染色后鏡下觀察病理切片的結(jié)果已清晰顯示，與對(duì)照組相比，給藥組瘤組織已呈現(xiàn)不同程度壞死。

4 結(jié) 論

采用18F－FLT MicroPET 對(duì)順鉑療效進(jìn)行了評(píng)價(jià)，與傳統(tǒng)抗腫瘤藥藥效評(píng)價(jià)方法進(jìn)行相比，并結(jié)合病例組織學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)A549肺癌模型在給藥后第2d用Micro PET即可觀察到腫瘤攝取明顯下降，比腫瘤體積檢測(cè)早7d。提示PET顯像可早期監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)分子水平功能變化，與傳統(tǒng)方法如腫瘤體積測(cè)量相比，能更早、更精準(zhǔn)地對(duì)抗腫瘤藥物的藥效進(jìn)行評(píng)價(jià)。該方法有望在抗腫瘤、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)、葡萄糖代謝等藥物的藥效評(píng)價(jià)中得到進(jìn)一步應(yīng)用。

致謝：感謝江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所分子影像中心楊敏博士及其課題組成員在動(dòng)物模型構(gòu)建及數(shù)據(jù)分析方面提供的幫助；感謝江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所黃洪波在 Micro PET顯像方面提供的幫助；感謝江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所江原醫(yī)院病理科戴主任在病理切片實(shí)驗(yàn)部分提供的幫助。

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