魏魁杰 張雷 楊筱 韓偉 鐘來平 葉冬霞 張志愿

（1.湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院 口腔系，湖州 313000；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 口腔頜面外科，上海 200011）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，患者5年生存率約為50%，對(duì)于腫瘤晚期和復(fù)發(fā)患者，生存率更低[1]。因此尋找有效的生物標(biāo)志物、闡明其發(fā)病機(jī)制十分重要。

本研究利用口腔黏膜上皮體外癌變模型[2-3]，在前期工作中采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，鑒定出癌變形成細(xì)胞較永生化細(xì)胞高表達(dá)的細(xì)胞角蛋白17（cytokeratin 17，CK17）。CK17是構(gòu)成細(xì)胞骨架的一種酸性多肽，在乳腺癌、子宮頸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)[4-7]。本研究旨在探討CK17在口腔黏膜上皮體外癌變模型、口腔鱗癌細(xì)胞株及臨床組織標(biāo)本中的表達(dá)情況及臨床意義，以期為口腔鱗癌的診斷和預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑與器材

細(xì)胞培養(yǎng)基Defined keratinocyte-SFM、DMEM和RPMI-1640（Gibco公司，美國(guó)），RNA提取試劑（Invitrogen公司，美國(guó)），實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（TaKaRa公司，日本），Western鼠抗熒光抗體（Fermentas公司，立陶宛），EnVision鼠兔共抗二抗（Dako Cytomation公司，丹麥），CK17鼠抗人單克隆抗體（Millipore公司，美國(guó)），Odyssey激光成像分析系統(tǒng)（LI-COR Biosciences公司，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

口腔黏膜上皮體外癌變模型中的永生化細(xì)胞（human immortalized oral epithelia cell，HIOEC）、HB56及HB96細(xì)胞、舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113均由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤生物實(shí)驗(yàn)室建系，舌鱗癌細(xì)胞株TSCC由武漢大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院建系并惠贈(zèng)，CAL27購(gòu)自美國(guó)American Type Culture Collection（ATCC）公司，口腔鱗癌細(xì)胞株OSC由日本高知大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。HIOEC采用Defined keratinocyte-SFM培養(yǎng)，HB56、HB96和CAL27采用DMEM（含10%FBS，2×105U·L-1青、鏈霉素）培養(yǎng)，Tca8113、TSCC、OSC細(xì)胞用RPMI-1640（含10%FBS，2×105U·L-1青、鏈霉素）培養(yǎng)。所有細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 組織標(biāo)本

選取2007年2—7月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科手術(shù)切除的原發(fā)口腔鱗癌組織標(biāo)本30例，患者術(shù)前未經(jīng)過放、化療，且均知情同意。30例患者中，男性21例，女性9例；年齡31～84歲，平均年齡53.8歲。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（Union Internationale Contre Le Cancer，UICC）2002分類，T1 6例，T2 13例，T3 4例，T4 7例；N0 16例，N1-2 14例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ級(jí)（早期）13例，Ⅲ、Ⅳ級(jí)（晚期）17例；病理分級(jí)：高分化12例，中分化15例，低分化3例。術(shù)中切取腫瘤實(shí)體內(nèi)組織和腫瘤邊界2 cm外的癌旁組織立即投入液氮后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，癌旁組織經(jīng)病理證實(shí)為正常黏膜組織。

1.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)

待細(xì)胞豐度至70%～80%，按1×107收集細(xì)胞，移入1.5mL離心管中；取組織塊約50mg置研缽中，加入液氮后迅速研磨成粉末狀，分別加入1mL Trizol，根據(jù)RNA提取試劑盒操作步驟分別抽提各細(xì)胞及癌與癌旁組織總RNA，測(cè)定質(zhì)量濃度。取2μg總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后采用20μL反應(yīng)體系，以cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增CK17上游序列：5’-GAGATTGCCACCTACCGC-3’，下游序列：5’-TGCCATCCTGGACCTCTT-3’，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為118 bp。內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白上游序列：5’-TGGATCAGCAAGCAGGAGTAT-3’，下游序列：5’-GGTTTTGTCAAGAAAGGGTGTAACG-3’，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為100bp。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃、10 s，95℃、5 s，60℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)，β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)Livak等[8]推導(dǎo)的2-ΔΔCt分別計(jì)算細(xì)胞系中目的基因相對(duì)內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量以及口腔鱗癌癌組織相對(duì)癌旁組織中目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 免疫印跡反應(yīng)

待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%匯合，每1×107細(xì)胞加入1mL預(yù)冷的2×組織細(xì)胞蛋白裂解液（含125mmol·L-1Tris-HCl、5%十二烷基硫酸鈉、24.75%甘油）提取總蛋白，Bradford法蛋白定量，每孔總蛋白上樣量50μg，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h后，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入1∶1 000稀釋的鼠抗人CK17單克隆抗體4℃孵育過夜。經(jīng)過含0.1%Tween-20的磷酸鹽緩沖液洗滌后，與1∶1 000稀釋的熒光二抗在室溫下孵育1 h。采用Odyssey激光成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，測(cè)定電泳條帶的積分密度值，以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照。

1.6 免疫組化檢測(cè)

石蠟連續(xù)切片4μm，常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2作用20min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.01mol·L-1pH6.0枸櫞酸鹽緩沖液水浴加熱法抗原修復(fù)，滴加1∶100稀釋的CK17鼠抗人的單克隆抗體50μL，濕盒內(nèi)4℃過夜，次日室溫下復(fù)溫1 h；滴加EnVision鼠兔共抗二抗50μL，室溫孵育40min；0.04%DAB顯色1～5min，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間；蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為空白對(duì)照。CK17的染色結(jié)果由2名病理科醫(yī)生采用雙盲法鏡檢，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率，結(jié)果記錄：陰性記為0分，1%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～100%記為3分。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)癌組織與癌旁組織中CK17 mRNA表達(dá)進(jìn)行單樣本t檢驗(yàn)，對(duì)CK17的表達(dá)水平與口腔鱗癌患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系、癌組織與癌旁組織中CK17蛋白的表達(dá)進(jìn)行非參數(shù)分析配對(duì)樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CK17 mRNA和蛋白在體外癌變模型和口腔鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果：與永生化HIOEC細(xì)胞相比，CK17 mRNA在HB56和OSC細(xì)胞株中表達(dá)明顯升高，而在HB96、Tca8113、TSCC和CAL27細(xì)胞中有不同程度的降低（圖1）。Western blot印跡檢測(cè)結(jié)果：與永生化HIOEC細(xì)胞相比，CK17蛋白表達(dá)水平在HB細(xì)胞及所有口腔鱗癌細(xì)胞株中均有不同程度的升高（圖2，3）。

2.2 CK17 mRNA在口腔鱗癌組織標(biāo)本中的表達(dá)

對(duì)30例口腔鱗癌癌組織相對(duì)于癌旁組織中CK17基因的表達(dá)變化倍數(shù)進(jìn)行分析：口腔鱗癌組織中CK17 mRNA水平是癌旁組織的（3.041±3.504）倍，癌組織中CK17基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于癌旁組織（t=3.191，P=0.003）。CK17的表達(dá)水平與口腔鱗癌患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系見表1。

在分析口腔鱗癌中CK17基因水平與各臨床病理指標(biāo)關(guān)系時(shí)，僅發(fā)現(xiàn)直徑大小不同的腫瘤間CK17 mRNA水平呈差異表達(dá)（P=0.035），但是進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這種差異表達(dá)并未呈現(xiàn)出一種趨勢(shì)，即隨著腫瘤直徑的增加，CK17 mRNA表達(dá)上升或下調(diào)，另外，CK17 mRNA表達(dá)水平與其他臨床病理指標(biāo)間均無明顯相關(guān)性（表1）。

2.3 CK17蛋白在口腔鱗癌組織標(biāo)本中的表達(dá)

口腔鱗癌患者的癌組織和癌旁組織中CK17蛋白表達(dá)情況見表2和圖4。在癌旁組織中，CK17蛋白的染色稍淺，陽(yáng)性細(xì)胞率稍低；而在癌組織中CK17均為陽(yáng)性表達(dá)，染色較深，主要表達(dá)在細(xì)胞漿中。用非參數(shù)分析配對(duì)樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗(yàn)，Z=-3.892，P＜0.001，二者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明口腔鱗癌患者癌組織中CK17陽(yáng)性表達(dá)程度顯著高于癌旁組織。CK17蛋白的表達(dá)與煙酒嗜好、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和病理分化程度均無明顯相關(guān)性。

表2 30例口腔鱗癌癌組織和癌旁組織中CK 17蛋白表達(dá)Tab 2 The CK 17 protein expression in cancerous and para-cancerous tissues from 30 OSCC patients

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌的致癌過程是一個(gè)多因素、多步驟發(fā)展的過程，在生物因素、化學(xué)因素和血清中生長(zhǎng)因子等多種因素的作用下，多種蛋白水平發(fā)生改變，出現(xiàn)細(xì)胞異常增殖，導(dǎo)致腫瘤形成。本課題前期研究已建立了國(guó)內(nèi)第一株人永生化口腔上皮細(xì)胞株HIOEC[2]，并利用苯丙芘誘導(dǎo)HIOEC細(xì)胞，形成具有裸鼠皮下成瘤能力等惡性表型的HB細(xì)胞株，包括HB56、HB96細(xì)胞，從而建立了人口腔黏膜上皮細(xì)胞體外癌變細(xì)胞模型[3]。從HIOEC到HB細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程可能伴隨一些重要的基因表達(dá)或功能變化，本課題組在前期工作中應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法，從HIOEC和HB細(xì)胞中鑒定出50多個(gè)差異表達(dá)蛋白，CK17是其中之一[9]。

為了驗(yàn)證比較蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡方法檢測(cè)CK17 mRNA和蛋白在體外癌變模型和口腔鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)。結(jié)果顯示：相對(duì)于HIOEC細(xì)胞，CK17 mRNA在HB56和OSC中表達(dá)上調(diào)，而在HB96及其他口腔鱗癌細(xì)胞株中有不同程度的降低，CK17蛋白在HB56、HB96和所有口腔鱗癌細(xì)胞株中均有不同程度的升高，提示CK17的表達(dá)上升可能在口腔鱗癌細(xì)胞株中是普遍現(xiàn)象。Lalli等[10]研究表明：在癌前病變口腔黏膜下纖維化（oral submucous fibrosis，OSF）中CK17蛋白表達(dá)上升，且與病變嚴(yán)重程度有關(guān)。上述研究結(jié)果均表明CK17可能在口腔鱗癌的發(fā)生過程中起到一定的作用。

對(duì)臨床標(biāo)本的研究結(jié)果顯示：癌組織中CK17 mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯高于癌旁組織，與比較蛋白質(zhì)組學(xué)及細(xì)胞株中免疫印跡結(jié)果一致，也與其他學(xué)者[4-7]在乳腺癌、子宮頸癌、肺癌等惡性腫瘤中的研究結(jié)果相一致。本研究中也發(fā)現(xiàn)無論從基因還是蛋白水平上，CK17的表達(dá)與各臨床病理指標(biāo)之間均無明顯相關(guān)性。而在既往的口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究中，有學(xué)者[11-12]發(fā)現(xiàn)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中CK17 mRNA表達(dá)升高，認(rèn)為可以利用檢測(cè)CK17 mRNA表達(dá)水平來預(yù)測(cè)是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

以上研究結(jié)果表明：CK17在口腔黏膜上皮癌變過程中表達(dá)上調(diào)可能與口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可作為口腔鱗癌早期診斷的檢測(cè)指標(biāo)。當(dāng)然本研究也發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞學(xué)水平上CK17存在基因和蛋白表達(dá)不同步的現(xiàn)象，與Sesterhenn等[13]在頭頸部鱗癌中的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)在15種頭頸部鱗癌細(xì)胞株中，只有3株CK17 mRNA高表達(dá)，1株CK17蛋白高表達(dá)，而在15例頭頸鱗癌組織標(biāo)本中10例標(biāo)本CK17 mRNA高表達(dá)，所有標(biāo)本CK17蛋白高表達(dá)。這種基因和蛋白表達(dá)不同步的現(xiàn)象，可能與基因轉(zhuǎn)錄后的修飾如甲基化、磷酸化或泛素化有關(guān)，今后還需要進(jìn)一步采用基于基因轉(zhuǎn)染和小RNA干擾等手段的基因功能研究和長(zhǎng)期大量的臨床病例隨訪研究，以闡明CK17在口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制。

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