李君華,吳 萌,李春生,齊穎穎,張小兵,閆靜輝
(河北省科學(xué)院生物研究所,河北 石家莊 050081)
磺胺類藥物(Sulfonamides,SAS)是具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱,在食源性動(dòng)物的飼養(yǎng)中,被作為獸藥廣泛應(yīng)用,在動(dòng)物疾病防治方面具有顯著的療效[1]?;前范奏奏ぃ⊿ulfamethazine SM2),作為磺胺類藥物的一種,具有性質(zhì)穩(wěn)定、抑菌譜廣、毒性小、口服易吸收、價(jià)格低廉等特點(diǎn),是畜牧業(yè)上應(yīng)用最廣泛、應(yīng)用量最大的藥物之一。但它在體內(nèi)的作用時(shí)間和代謝時(shí)間較長(zhǎng),易殘留在動(dòng)物體內(nèi),并可通過(guò)食物等途徑在人體中蓄積。藥物蓄積濃度超過(guò)一定值對(duì)人體機(jī)能是有害的,長(zhǎng)期蓄積則會(huì)導(dǎo)致磺胺類藥物抗藥性的產(chǎn)生,造成耐藥菌的流行性感染,且有潛在的致癌性[2]。因此,歐盟對(duì)牛奶和肉類食品中的磺胺類藥物制定了最高允許值,即磺胺類藥物總量不得超過(guò)100 μg/kg,單個(gè)磺胺類藥物的濃度不得超過(guò)25 μg/kg[3]。2002年12月我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)文件規(guī)定:在所有食品動(dòng)物的肌肉、脂肪、肝和腎中,磺胺類藥物最高殘留限量100 μg/kg,并將磺胺二甲嘧啶列為獸藥殘留監(jiān)控的重點(diǎn)[4]。
磺胺二甲嘧啶屬于小分子化合物,分子量為278.32,因?yàn)樾》肿颖旧聿痪哂姓T導(dǎo)產(chǎn)生抗體的能力,故必須將小分子與載體蛋白偶聯(lián)合成出人工完全抗原,才能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體。本文旨在利用重氮化法合成抗原,以此制備出效價(jià)高、特異性強(qiáng)的單克隆抗體,為該藥物的免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。
SM2,磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine SMT),純度99%,Sigma;Sp2/0細(xì)胞(本研究室保存);雌性BALB/c小鼠(河北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumen,BSA),卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA),HAT、HT、福氏佐劑、PEG4000、免疫球蛋白亞型試劑盒,均購(gòu)自Sigma;細(xì)胞培養(yǎng)板、DMEM培養(yǎng)基,購(gòu)自GIBCO公司;HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物科技有限公司);亞硝酸鈉,氨基磺酸等試劑均為分析純。
1.1.1 儀器設(shè)備 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Tecan公司);凝膠成像儀(SYNGENE);CO2培養(yǎng)箱(SANYO);倒置顯微鏡(Olympus);U-3000紫外掃描儀(日本島津);722型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海分析儀器廠);紅外光譜儀(Thermo)。
1.2.1 人工抗原合成 SM2-BSA完全抗原的合成采用重氮化法[5-6]并加以改進(jìn)。稱取55.6 mg的SM2溶于1 mL 1 mol/L的HCl中,并保持在4℃,稱取15 mg亞硝酸鈉溶于1 mL蒸餾水中,緩慢滴加入SM2溶液,邊滴加邊攪拌,保持pH值低于3。反應(yīng)結(jié)束后用氨基磺酸消耗過(guò)量的亞硝酸,用淀粉碘化鉀試紙檢測(cè),直至滲圈從深藍(lán)色變成淺黃色為止。稱取50 mg BSA溶于2 mL 1 mol/L pH值為9.6碳酸鈉緩沖液中,即配成BSA溶液。在4℃放置1h后,將以上活化的SM2溶液逐滴加入BSA溶液中,反應(yīng)過(guò)程中保持pH值為9,在4℃攪拌反應(yīng)6 h后,用0.01 mol/L的PBS透析3 d,每天換液2次,即制備得SM2-BSA。SM2-OVA的制備亦按此方法。
1.2.2 人工抗原鑒定 SDS-PAGE鑒定:選擇分離膠濃度為12%,濃縮膠為5%,對(duì)合成物進(jìn)行SDSPAGE鑒定,并用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析軟件估算BSA與SM2的偶聯(lián)比。
紫外光譜掃描(UV)鑒定:用PBS對(duì)SM2和BSA進(jìn)行適當(dāng)稀釋,測(cè)定BSA的蛋白濃度,把SM2-BSA稀釋到與BSA相同濃度,在220~400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外掃描[7]。并根據(jù)式(1)計(jì)算偶聯(lián)比[8]。
偶聯(lián)比=(SM2含量/SM2分子質(zhì)量)/(BSA含量/BSA分子質(zhì)量) (1)
紅外光譜(IR)鑒定:將 SM2、BSA、OVA、SM2-BSA、SM2-OVA的干粉與適量的KBr,在紅外燈照射下研磨、混勻后壓片,進(jìn)行紅外掃描。
1.3.1 單克隆抗體的制備 選用3只8周齡BALB/c小鼠,采用頸背部多點(diǎn)免疫,第一次免疫采用福氏完全佐劑,后面的免疫均采用福氏不完全佐劑,在免疫4次后,斷尾取血,用間接ELISA法測(cè)定效價(jià),選取最佳免疫小鼠進(jìn)行融合[9-12]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞,按常規(guī)方法進(jìn)行融合,采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液,篩選陽(yáng)性孔,利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化,建立穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株,液氮保存,并將擴(kuò)大培養(yǎng)的建株細(xì)胞注入致敏小鼠的腹腔,制備腹水。
1.3.2 單克隆抗體的特性分析 (1)SM2抗體的效價(jià)測(cè)定:采用間接ELISA法測(cè)定抗體的效價(jià),用合成的SM2-OVA包被酶標(biāo)板,以P/N 2.1時(shí)的單抗稀釋倍數(shù)為此單抗的效價(jià)。(2)SM2抗體的敏感性測(cè)定[13]:采用阻斷ELISA測(cè)定SM2 mAb對(duì)SM2的半數(shù)抑制濃度(IC50),以 IC50衡量敏感性。(3)SM2 抗體的亞型測(cè)定[14]:用Sigma公司的免疫球蛋白亞型試劑盒進(jìn)行測(cè)定。(4)SM2抗體的親和常數(shù)測(cè)定[9]:采用非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫法測(cè)定SM2的親和常數(shù)。(5)SM2抗體的特異性測(cè)定:用阻斷ELISA測(cè)定SM2的2株抗體與磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺甲惡唑、磺胺六甲氧嘧啶、磺胺氯砒嗪等類似物的交叉反應(yīng)率。
由圖1可知,SM2-BSA條帶滯后于BSA,且?guī)斡悬c(diǎn)散,明顯區(qū)別于BSA,說(shuō)明偶聯(lián)成功。經(jīng)紫外凝膠成像系統(tǒng)分析軟件估算得:SM2-BSA的分子量為70KD,BSA的分子量為66.2KD,推算出偶聯(lián)比為:14∶1,OVA-SM2 的偶聯(lián)比為 10.5∶1。
圖1 SDS-PAGE鑒定結(jié)果
由圖2可知,BSA的最大吸收峰為278 nm,SM2的最大吸收峰為260 nm,SM2-BSA的最大吸收峰明顯向左偏移,在240nm處,說(shuō)明偶聯(lián)成功。根據(jù)朗伯比爾定律(楊利國(guó)等)[8],推算出偶聯(lián)比為:13∶1,驗(yàn)證了 SDS-PAGE 的結(jié)果。
圖2 紫外光譜掃描結(jié)果
由圖3~圖5可知,在600~1 600的波數(shù)范圍內(nèi),將SM2-BSA和BSA的特征曲線相比較,有明顯不同,但與SM2的特征曲線有些相似,說(shuō)明合成物中含有SM2。紅外光譜掃描的結(jié)果可以證明SM2偶聯(lián)到BSA上。
檢測(cè)原SM2-OVA以濃度0.5 μg/mL的包被量包板,采用間接ELISA法測(cè)定SM2單抗的上清及腹水的效價(jià),如表1所示,4H4和3A12兩株腹水均具有較高的效價(jià)。
圖3 SM2紅外掃描譜圖
圖4 BSA紅外掃描圖
圖5 SM2-BSA紅外掃描圖
表1 SM2上清及腹水的效價(jià)測(cè)定
用阻斷ELISA法測(cè)定SM2抗體對(duì)不同濃度的SM2的抑制率,以抑制百分比B/B0(%)為縱坐標(biāo),SM2濃度的Log值為橫坐標(biāo),繪制SM2抗體的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。在0.5~40.5 ng/mL的范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,R2=0.996 2,3A12的 IC50為 0.6 ng/mL,表明對(duì)SM2具有較高的敏感性,見(jiàn)圖6。4H4的IC50為1.8 ng/mL,見(jiàn)圖7。
圖6 阻斷ELISA檢測(cè)SM2-3A12 IC50
圖7 阻斷ELISA檢測(cè)SM2-4H4 IC50
用抗體亞型試劑盒進(jìn)行鑒定,4H4為IgG2a,3A12為 IgG1。
采用間接ELISA法測(cè)定SM2的親和常數(shù),以抗體濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),以O(shè)D值為縱坐標(biāo),繪制 S 型曲線,K(3A12)=4.9×109L/mol,K(4H4)=8.3×108L/mol,這兩株抗體的親和力都較高。
用阻斷ELISA法測(cè)定SM2的2株抗體與磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺甲惡唑、磺胺六甲氧嘧啶、磺胺氯砒嗪等類似物的交叉反應(yīng)率,CR(%)均小于 0.1%(表 2)。
表2 SM2與7種磺胺類交叉反應(yīng)結(jié)果
傳統(tǒng)的獸藥殘留分析主要是采用氣相色譜、高效液相色譜、質(zhì)譜等理化技術(shù)進(jìn)行定性、定量分析,這些方法結(jié)果準(zhǔn)確,但是存在前處理繁瑣、儀器昂貴、專業(yè)化要求高等不足。與之比較,微生物法操作簡(jiǎn)便,但是特異性和靈敏度低。酶聯(lián)免疫方法是基于抗原抗體特異性的免疫反應(yīng),靈敏度高,適用于大批量的樣品檢測(cè),操作方便,對(duì)操作者的專業(yè)要求比較低[15]。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)重氮化法,合成制備了免疫原和檢測(cè)原,通過(guò)免疫篩選出了具有高特異、高敏感的抗SM2的細(xì)胞株。建立以單克隆抗體為基礎(chǔ)的藥物殘留檢測(cè)體系,進(jìn)而開發(fā)市場(chǎng)需要的藥物殘留ELISA檢測(cè)試劑盒,這些內(nèi)容需要在今后的工作中作進(jìn)一步的研究。
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