趙嚴(yán)偉，黃志剛，李合松

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

原生質(zhì)體是重要的生物材料，廣泛地應(yīng)用于植物學(xué)研究的各個(gè)方面，如細(xì)胞雜交、亞細(xì)胞定位、基因瞬時(shí)表達(dá)、啟動(dòng)子分析等[1]。但原生質(zhì)體在分離過程中受到的酶解壓力可能影響其重要的生理狀態(tài)，如形態(tài)改變、再生能力喪失等[2]。酶解壓力主要由酶解時(shí)間和酶濃度造成，時(shí)間越長(zhǎng)、濃度越高，壓力越大[3]。因此，這對(duì)在較小的壓力下得到大量的有活力原生質(zhì)體具有一定意義，使其能更好地應(yīng)用于后續(xù)研究工作，提高試驗(yàn)成功率。

植物激素中的IAA可通過激活細(xì)胞壁水解酶，加速木葡聚糖的降解[4]，從而有可能減少酶處理的濃度與時(shí)間。前人的研究主要集中于原有的分離純化條件中諸因素的優(yōu)化[3]，或通過施加抗壞血酸（ASA）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等[5]抑制膜損傷來提高原生質(zhì)體的數(shù)量與活力，而對(duì)植物激素應(yīng)用于原生質(zhì)體分離的研究較少。筆者以擬南芥為材料，主要通過不同濃度的IAA處理擬南芥葉片，探討其對(duì)原生質(zhì)體分離的影響以及IAA處理是否有利于降低酶解壓力，分析最合適的IAA施用濃度、酶解時(shí)間與酶濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 哥倫比亞野生型擬南芥（Arabidopsis accessions：Col-0），種子由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

種子經(jīng)4℃春化處理3 d，播種于培養(yǎng)基質(zhì)（營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶3）中，光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度22℃，光/暗周期12/12 h，濕度70%。取生長(zhǎng)35 d叢生葉片的第7、8、9片平展葉為試驗(yàn)材料。

1.1.2 試 劑 纖維素酶R-10，離析酶R-10，MES，IAA 等。

1.2 方法

1.2.1 IAA處理 在分離原生質(zhì)體2 h前，對(duì)分離材料擬南芥葉片表面噴灑IAA。

1.2.2 原生質(zhì)體分離 試驗(yàn)方法基本參照Yoo等[6]的方法，材料鮮重與酶液體積比例為1∶10。基本步驟：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的擬南芥葉片切成2 mm左右寬度的細(xì)絲后立即浸入含1.0%纖維素酶R-10及0.2%離析酶R-10的酶解液中，23℃黑暗靜置4 h，細(xì)胞篩過濾，100 g×1 min離心純化2次，棄上清液。每個(gè)處理的材料量均為50 mg擬南芥葉片，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù) 計(jì)數(shù)方法及規(guī)則參照郭軍英[7]的方法，中性紅（0.01%）染色鑒定原生質(zhì)體的活力[8]。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 不同酶解方式下IAA處理對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 為探明IAA處理對(duì)原生質(zhì)體分離的影響是否與酶的種類有關(guān)，設(shè)置了雙酶混合處理與纖維素酶+離析酶、離析酶+纖維素酶兩種單酶依次處理。IAA處理濃度為10-5mol/L。

1.3.2 不同濃度IAA處理對(duì)原生質(zhì)體數(shù)量與活力的影響選用L9（34）正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（表1），研究纖維素酶R-10濃度、果膠酶R-10濃度與IAA處理濃度對(duì)擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體分離效果的影響。

1.3.3 不同酶解時(shí)間下IAA處理對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力的影響 選用0.6%纖維素酶+0.2%離析酶+10-7mol/L IAA組合作為IAA處理組，比較IAA處理組與對(duì)照1（0.6%纖維素酶+0.2%離析酶）及對(duì)照2（1.0%纖維素酶+0.2%離析酶）在1～4 h的原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力差異，分析IAA對(duì)原生質(zhì)體分離的作用與酶解時(shí)間的關(guān)系。

表1 正交因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶解方式下IAA處理對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

從表2看出，不同酶解方式對(duì)IAA處理的反應(yīng)不同。雙酶混合處理下原生質(zhì)體數(shù)量顯著高于單酶依次處理。10-5mol/L IAA處理對(duì)原生質(zhì)體分離有顯著影響，降低了原生質(zhì)體數(shù)量40%左右，只有纖維素酶在前的單酶依次處理中IAA組原生質(zhì)體數(shù)量高于對(duì)照組，約是后者的2.4倍。

表2 不同酶解方式下IAA處理對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

2.2 不同濃度IAA處理對(duì)原生質(zhì)體數(shù)量與活力的影響

如表3、表4所示，IAA濃度對(duì)活力原生質(zhì)體數(shù)量有顯著影響，影響程度為IAA濃度＞纖維素酶R-10濃度＞離析酶R-10濃度。雙因素交互作用方差分析表明（數(shù)據(jù)未顯示）三個(gè)因素間無相互作用。表5表明A1B2C2為最佳組合，在正交試驗(yàn)中，即0.6%纖維素酶+0.2%離析酶+10-7mol/L IAA。A因素間差異不顯著，B因素間差異不顯著，C3與C1和C2有顯著性差異（表5）。

表3 擬南芥原生質(zhì)體分離正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 無相互作用的方差分析表

表5 三因素均數(shù)表

2.3 不同酶解時(shí)間下IAA處理對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力的影響

表6表明，IAA處理后的擬南芥葉片能在較少的纖維素酶濃度下（0.6%）得到大量的有活力的原生質(zhì)體，與對(duì)照1相比提高了31.1%（4 h），與正常的對(duì)照組2相比，IAA處理組一直保持較高的活力，且在酶解1～3 h后的原生質(zhì)體數(shù)量高于對(duì)照2。

表6 不同酶解時(shí)間下IAA處理對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力的影響

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，IAA對(duì)原生質(zhì)體分離有較大影響，且對(duì)纖維素酶R-10與離析酶R-10的影響不同，在10-5mol/L IAA處理葉片后，纖維素酶先酶解的材料與離析酶先酶解的材料原生質(zhì)體數(shù)量分別比對(duì)照組提高了1.4倍和降低了40%左右，表明IAA可能主要對(duì)纖維素酶起作用。正交試驗(yàn)分析表明，0.6%纖維素酶+0.2%離析酶+0.1 μmol/L IAA是較好的酶解組合，能在3 h內(nèi)獲得大量有活力的原生質(zhì)體，且在4 h內(nèi)的活力均高于1.0%纖維素酶+0.2%離析酶組合，同時(shí)與未經(jīng)IAA處理的對(duì)照1（0.6%纖維素酶+0.2%離析酶）相比，原生質(zhì)體數(shù)量有較大提高，3 h時(shí)差異最大，原生質(zhì)體數(shù)量提高了約1.3倍，表明這種提高是由IAA處理引起的。方差分析發(fā)現(xiàn)，IAA濃度對(duì)活力原生質(zhì)體數(shù)量有顯著影響，但纖維素酶濃度對(duì)其無顯著影響，且三因素間無相互作用，暗示IAA作用的主要目標(biāo)可能不是外施的纖維素酶，而是激發(fā)了細(xì)胞壁上本身存在的纖維素酶。

綜上所述，IAA處理可提高酶解反應(yīng)的速度。合適的IAA處理濃度可在一定程度上減少酶的使用濃度及酶解時(shí)間，從而降低酶解壓力，提高原生質(zhì)體活力。

10-7mol/L的IAA能有效提高活力原生質(zhì)體數(shù)量，而過高的IAA施用濃度可能由于過度激發(fā)壁上纖維素酶功能，而造成原生質(zhì)體的破裂。

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