寧停波 ，張 婷 ，周金燕 ，楊 杰 ，譚 紅

（1.中國科學(xué)院成都生物研究所應(yīng)用與環(huán)境微生物研究中心，四川 成都 610041；2.中國科學(xué)院研究生院生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049）

近年來，農(nóng)用抗生素的篩選和應(yīng)用已成為農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，利用放線菌產(chǎn)生的抗生素制備的新農(nóng)藥已逐漸成為無公害農(nóng)藥的主體[1]。因此，從放線菌的發(fā)酵液中尋找新的農(nóng)用抗生素產(chǎn)物成為當(dāng)前國內(nèi)外的一個研究熱點(diǎn)[2]。

核苷類抗生素具有多樣的生物活性[3]，在醫(yī)療、農(nóng)藥方面都有重要應(yīng)用。由于來源于微生物的核苷類抗生素具有低毒和環(huán)境友好的特點(diǎn)，且在抗菌、殺蟲和抗病毒等方面具有較強(qiáng)的作用，所以相關(guān)研究越來越受到關(guān)注[4]。本實(shí)驗(yàn)室從攀西地區(qū)土壤中篩選得到一株諾爾斯鏈霉菌（streptomyces noursei），該菌產(chǎn)生一種具有高效、廣譜抗菌作用的新型核苷類農(nóng)用抗生素——新奧霉素（專利申請?zhí)枺?00910060121.4），經(jīng)多輪誘變選育，已具有工業(yè)開發(fā)價(jià)值。本文就新奧霉素發(fā)酵液的理化性質(zhì)及其提取方法進(jìn)行了研究，為新奧霉素的發(fā)酵生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

菌種：本實(shí)驗(yàn)室從攀西地區(qū)土壤中篩選得到的諾爾斯鏈霉菌（streptomyces noursei）XiAo-3。生測指示菌：蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），購自云南省微生物研究所保藏中心。生測培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。發(fā)酵液：諾爾斯鏈霉菌（streptomyces noursei）XiAo-3經(jīng)發(fā)酵罐發(fā)酵后提供。試劑和儀器：硅膠G薄層板、硅膠G200～300目（青島海洋化工），C18反相硅膠（YMC）；甲醇、氯仿、正丁醇、冰乙酸為分析純，去離子水；微濾裝置（成都連接流體分離科技有限公司），納濾膜（GE Water&Process Technologies），BUCHI-114 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SBS-100型數(shù)控記滴自動分部收集器，高壓液相色譜系統(tǒng)為SHIMADZU（島津）液相色譜儀系統(tǒng)。

1.2 發(fā)酵液的預(yù)處理

發(fā)酵液中添加珍珠巖助濾劑，經(jīng)過濾去除菌體和培養(yǎng)基殘?jiān)?/p>

1.3 發(fā)酵液理化性質(zhì)

1.3.1 熱穩(wěn)定性 各取10 mL發(fā)酵液于5支試管中，分別于 40、60、80、100℃下靜置 30、60、90 min，定時(shí)取出2 mL發(fā)酵液留作生測樣品，冷卻至室溫，管碟法測抑菌圈直徑，每個樣品重復(fù)3次。

1.3.2 pH穩(wěn)定性 將發(fā)酵液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH 分別調(diào)節(jié) pH 值至 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，靜置 24h 后，均調(diào)回發(fā)酵液初始 pH值，以未處理的發(fā)酵液為對照，管碟法測抑菌圈直徑，每個樣品重復(fù)3次。

1.3.3 紫外穩(wěn)定性 將等量的發(fā)酵液置于波長為254 nm的紫外燈下分別照射15、30、45和60 min，以未處理的發(fā)酵液為對照，管碟法測抑菌圈直徑，每個樣品重復(fù)3次。

1.4 新奧霉素的提取方法

新奧霉素發(fā)酵液經(jīng)助濾劑過濾后所得濾液，采用膜處理方法獲得新奧霉素濃縮液[5-6]；采用乙醇沉淀預(yù)處理發(fā)酵液，其上清液樣品經(jīng)過兩次正相硅膠柱層析，再經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮，可得白色或淡黃色粉末的新奧霉素。具體提取工藝路線，見圖1。

圖1 新奧霉素提取工藝

1.4.1 新奧霉素的膜提取方法 采用微濾（MF）—納濾（NF）組合分離法[7-8]制備新奧霉素濃縮液，具體工藝流程：將預(yù)處理的發(fā)酵液進(jìn)行微濾，其透過液再經(jīng)納濾，獲得新奧霉素濃縮液（圖2）。

1.4.2 乙醇沉淀 取4份發(fā)酵液，分別加入2、4、6、8 倍體積無水乙醇，靜置 1h，離心（6 000 r/min，15 min），分離上清液和沉淀，以未處理發(fā)酵液為對照，管碟法測抑菌圈直徑，每個樣品重復(fù)3次。

圖2 微濾-納濾裝置

1.4.3 正相硅膠柱層析 取適量乙醇沉淀上清濃縮液干法上樣，兩次正相硅膠柱層析的上樣量與硅膠裝柱量比例分別為1∶5、1∶67，采用不同梯度的氯仿/甲醇/水洗脫。

1.5 檢測方法

1.5.1 抑菌活性的測定 取含菌量為（6.4～10）×107個/mL蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）懸液，以體積比0.5%的比例添加到58℃左右的生測培養(yǎng)基中，混勻后迅速制成平板培養(yǎng)基，待凝固后將滅菌的牛津杯等距離均勻擺放，每個牛津杯加樣量200 μL（所有樣品均稀釋30倍），置30℃恒溫培養(yǎng)17 h后，測量抑菌圈直徑。

1.5.2 HPLC檢測 色譜柱:Agilent HC-C18柱（4.6×250 mm），λ：265 nm，流動相：甲醇/水（5/95，加0.05%冰乙酸)，流速：0.5 mL/min，柱溫：40℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液的理化性質(zhì)

2.1.1 熱穩(wěn)定性 由表1可知，新奧霉素具有較好的熱穩(wěn)定性。發(fā)酵液分別在40、60和80℃條件下，保溫90 min后，新奧霉素活性基本一致；但溫度達(dá)到100℃，保溫90 min后活性有所下降。因此，在分離提取過程中應(yīng)盡量避免過高的溫度，減少對新奧霉素抑菌活性的影響。

表1 發(fā)酵液熱穩(wěn)定性

2.1.2 pH值穩(wěn)定性 新奧霉素發(fā)酵液初始pH值為3（CK），發(fā)酵液經(jīng)酸、堿分別處理后，回調(diào)pH值至3，生測結(jié)果見圖3。結(jié)果表明用酸對發(fā)酵液處理后，其活性有微小的上升，而用堿處理后，抑菌活性隨著pH值的升高，有所下降。

圖3 發(fā)酵液pH值的穩(wěn)定性

2.1.3 紫外穩(wěn)定性 從圖4可知，新奧霉素發(fā)酵液對紫外照射不敏感。發(fā)酵液經(jīng)過254 nm紫外光照射，抑菌活性無明顯變化，說明發(fā)酵液中的新奧霉素具有很好的紫外穩(wěn)定性，無需避光保存。

圖4 發(fā)酵液紫外穩(wěn)定性

2.2 新奧霉素的提取

2.2.1 膜分離提取新奧霉素 本實(shí)驗(yàn)采用管式陶瓷膜對發(fā)酵液進(jìn)行微濾，柱前后壓差1.3 kg，溫度25℃，流速8 L/h，透過液澄清且活性基本無變化。微濾透過液進(jìn)入納濾裝置，柱前后壓差0.7 kg，溫度28℃，流量4 L/h，濃縮了5倍，活性回收率達(dá)90%以上。納濾可節(jié)省生產(chǎn)消耗成本，其截留濃縮液可以進(jìn)一步進(jìn)行納濾濃縮，制備濃度更高的新奧霉素母液。

圖5 不同體積倍數(shù)乙醇沉淀發(fā)酵液的影響

2.2.2 乙醇沉淀發(fā)酵液 采用不同體積倍數(shù)無水乙醇處理發(fā)酵液，去除一些雜蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，隨著乙醇體積倍數(shù)的增大，析出的固形物增多，上清液的抑菌活性減?。▓D5），而沉淀的抑菌活性增加。當(dāng)使用8倍體積乙醇沉淀發(fā)酵液時(shí)，沉淀的抑菌圈直徑已與上清液的抑菌圈直徑相近，說明此時(shí)新奧霉素已被大量沉淀。綜合考慮無水乙醇用量和新奧霉素的活性收率，選擇用4倍體積無水乙醇處理發(fā)酵液，活性收率在90%以上。

2.2.3 新奧霉素的柱層析分離 發(fā)酵液醇沉上清濃縮液經(jīng)過第一次正相硅膠柱分離發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用第一梯度洗脫劑（氯仿/甲醇/水體積比為 6.5∶3.5∶0.7）時(shí)，能洗脫大量色素和其它弱極性的物質(zhì)；在第二梯度洗脫劑（氯仿/甲醇/水體積比 4.5∶5.5∶1.2）中，新奧霉素能夠被集中洗脫下來，在55℃減壓蒸發(fā)得到棕色膏狀樣品。此樣品經(jīng)第二次硅膠柱分離，合并收集活性部分的洗脫液，濃縮干燥，得到白色或淡黃色新奧霉素粉末，經(jīng)HPLC初步檢測新奧霉素峰面積大于97%，見圖6。

圖6 二次硅膠柱層析得到的新奧霉素HPLC圖譜

3 結(jié)論

新奧霉素是一種水溶性抗生素，其發(fā)酵液具有較好的紫外和熱穩(wěn)定性，對酸堿不敏感。通過對新奧霉素發(fā)酵液理化性質(zhì)的研究，可以有效地指導(dǎo)新奧霉素提取工藝條件，獲得較高的活性收率。新奧霉素發(fā)酵液添加珍珠巖助濾劑預(yù)處理，過濾得到的濾液，采用微濾-納濾組合分離法可以獲得體積濃縮5倍、活性收率90%以上的新奧霉素濃縮液；采用4倍體積無水乙醇沉淀和兩次正相硅膠柱層析，可以獲得含量大于97%的白色或淡黃色新奧霉素粉末。

利用膜工藝技術(shù)制備新奧霉素濃縮液的過程具有步驟簡單、耗能小等特點(diǎn)，且產(chǎn)品可進(jìn)一步加工為新奧霉素母液進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。由于本文提取新奧霉素粉末工藝的生產(chǎn)成本較高，所以還有待于進(jìn)一步改進(jìn)。

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