楊 揚(yáng) ，洪亞輝，黃 勇，姚小華，王開良

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；2.中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400；3.福建省林業(yè)科學(xué)研究院，福建 福州 350012）

小果油茶（Camellia meiocarpaHu.）又名江西子、小茶、雞心子等，是山茶科山茶屬植物，從其茶籽中提取的茶油是我國主要的木本食用油料。小果油茶主要分布在江西中南部、廣西東北部、湖南東南部、湖北東南部、廣東北部以及福建省的中南部和西北部[1]。由于多年來重采輕育，許多地區(qū)疏于管理，導(dǎo)致了小果油茶種植面積迅速縮小，“后繼無林”現(xiàn)象十分突出。因此，加快小果油茶品種改良步伐，提高良種化水平，成為了當(dāng)務(wù)之急。傳統(tǒng)育種方式很難對一個或者多個性狀進(jìn)行有效的改良，環(huán)境效應(yīng)又較易掩蓋基因效應(yīng)，因而育種者對目標(biāo)性狀的選擇既費(fèi)時又耗力。從分子水平上研究小果油茶的親緣關(guān)系與遺傳多樣性就顯得尤為重要。

目前遺傳結(jié)構(gòu)研究已成為保護(hù)遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)[2-4]。SRAP分子標(biāo)記是由Li和Quiros[5]開發(fā)的一種基于PCR擴(kuò)增的新型分子標(biāo)記技術(shù)。它是一個評價遺傳多樣性、品種鑒定和系統(tǒng)發(fā)生的有效工具。目前從分子角度對油茶的研究還幾乎處于空白，僅黃永芳等[6-7]利用RAPD、王保明等[8-11]利用ISSR，對不同油茶無性系的基因組DNA進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)論是不同油茶無性系基因型間存在著豐富的遺傳多樣性。SRAP分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、檢測手段簡單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，在臘梅（Chim onanthus praecox（L.）Link）[12]、新疆野蘋果（Malus sieversii）[13]、狗牙根（Cy nodon）[14]、老芒麥（El ymus sibi ricus）[15]等植物的遺傳多樣性研究應(yīng)用較廣。本試驗(yàn)使用SRAP技術(shù)對小果油茶種群的遺傳多樣性進(jìn)行了初步研究，以了解中國小果油茶的遺傳多樣性的現(xiàn)狀以及遺傳多樣性的變化規(guī)律，為小果油茶分類和良種選育提供一些科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：小果油茶的新鮮幼嫩葉片，采樣時單株間相距50 m以上，葉片用硅膠干燥保存。共采集6個不同群體的180份樣品（表1）。

表1 小果油茶群體生長地基本狀況

SRAP引物：根據(jù)Li和Quiros的SRAP引物設(shè)計原則設(shè)計引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。

1.2 方法

1.2.1 小果油茶總DNA的提取 采用改良CTAB[16]法提取小果油茶總DNA，在1%瓊脂糖凝膠上檢測DNA質(zhì)量，紫外分光光度計檢測DNA濃度，稀釋至 50 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SRAP-PCR擴(kuò)增 在鄭婷婷等[17]SRAP擴(kuò)增條件的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)了各種不同的擴(kuò)增條件，獲得了最佳擴(kuò)增反應(yīng)體系和步驟。小果油茶20 μL的擴(kuò)增體系：Taq 聚合酶量為 1.0 U，50 ng/μL 模板DNA， 2.5 mmol/L dNTPs，10 ×Buffer，50mmol/L Mg2+，10 mmol/L上游引物下游引物，不足部分由去離子水補(bǔ)足。

SRAP擴(kuò)增在ABI 2720 Thermal Cycler PCR儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增參見Li和Quiros[2]的方法，略有改動。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，5 個循環(huán)；94℃變性 1 min，50℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳結(jié)束后Na2CO3銀染法染色顯影，陰涼通風(fēng)處干燥，進(jìn)行掃描采集圖像，觀察分析條帶。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 選取清晰可辨的電泳條帶，有帶記為“1”，無帶記為“0”，得到原始 0，1 矩陣圖。運(yùn)用POPGENE3.2計算多態(tài)性條帶（N）、多態(tài)位點(diǎn)百分率（P）、觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei基因多樣性指數(shù)（H）和 Shannon信息指數(shù)（I）、群體內(nèi)總遺傳多樣性（Ht）、群體內(nèi)遺傳多樣性 (Hs)、群體間遺傳多樣（Dst）、群體間遺傳分化系數(shù)（Gst）和基因流動系數(shù)（Nm），Nei原則計算的 6個種群間的遺傳一致度和遺傳距離。基于遺傳一致度矩陣運(yùn)用NTSYS2.10進(jìn)行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性分析

從87對參試引物中篩選出重現(xiàn)性好、條帶清晰可辨、多態(tài)性高的9對引物用于SRAP擴(kuò)增（引物名稱和序列見表2）。供試引物共擴(kuò)增出了184個DNA片段，平均每個引物獲得20.4個位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)184個，占100%。各小果油茶的多態(tài)性位點(diǎn)比率分別是：龍勝群體為95.11%、三江群體為92.93%、融水群體為92.39%、黎平群體為94.57%、全州群體為79.89%、通道群體為91.30%。在9對引物組合之中Me8Em11擴(kuò)增的位點(diǎn)最多，共36個；Me1Em1與Me1Em4擴(kuò)增位點(diǎn)較少，計11個。這表明SRAP分子標(biāo)記對小果油茶基因組擴(kuò)增效果較好，能提供豐富的遺傳信息位點(diǎn)，是進(jìn)行小果油茶遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析的有效工具。

表2 SRAP引物名稱及序列

2.2 遺傳多樣性

圖1顯示了SRAP引物組合Me1Em4對小果油茶實(shí)生苗的基因組DNA擴(kuò)增情況。

圖1 引物組合Me1Em4對小果油茶基因組DNA的擴(kuò)增圖譜

如表3所示，9對SRAP引物共擴(kuò)增出184個位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)184個。由表3可知，6個群體內(nèi)的遺傳多樣性程度存在較大的差異，180份小果油茶材料的的平均有效等位基因數(shù)為1.776 3，平均Nei基因多樣性指數(shù)0.432 8，平均Shannon信息指數(shù)0.623 3。各群體間遺傳多樣性程度也存在一定差異，Nei基因多樣性指數(shù)在0.318 7～0.381 4之間，Shannon信息指數(shù)在0.467 1～0.557 8之間。

表3 小果油茶群體遺傳多樣性水平（括號內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)差）

2.3 遺傳分化系數(shù)與基因流

小果油茶群體總遺傳多樣性（Ht）為0.432 8，群體內(nèi)遺傳多樣性（Hs）為0.361 2，群體間的遺傳多樣性（Dst）為0.071 6，群體內(nèi)的的遺傳多樣性大于群體間的遺傳多樣性，表明小果油茶群體的遺傳變異主要存在于群體內(nèi)。小果油茶群體間的遺傳分化系數(shù)為0.165 4，說明不同種源間遺傳分化相對較低。群體物種水平上的基因流（Nm）為2.522 9[18]，表明小果油茶不同群體之間有著頻繁的基因交流。

2.4 遺傳一致度和遺傳距離

采用遺傳一致度和遺傳距離對群體之間相同之處和不同之處加以量化（表4）。小果油茶群體間的遺傳相似性較大，I值為0.803 3～0.922 9，D值為0.080 3～0.219 0。其中三江群體與龍勝群體的遺傳關(guān)系最近（I=0.922 9）；全州群體與龍勝群體的遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)（D=0.219 0），其中全州群體與其他5個群體差異顯著。

表4 小果油茶6個群體遺傳一致度和遺傳距離

2.5 聚類分析

根據(jù)小果油茶遺傳一致度矩陣運(yùn)用NTSYS2.10進(jìn)行UPGMA聚類分析，從圖2中看出，可以將6個群體歸為3個類群：龍勝群體與三江群體聚成一類，黎平群體、通道群體與融水群體聚為一類，全州群體單獨(dú)聚為一類。

圖2 6個小果油茶群體遺傳一致度UPGMA聚類

3 討論

3.1 小果油茶群體間的遺傳分化

6個小果油茶群體的總遺傳多樣性（Ht）為0.432 8，說明在小果油茶全部個體間存在豐富的遺傳多樣性，個體間遺傳變異顯著。其中有16.14%的遺傳變異存在于群體間，83.86%的遺傳變異存在于群體之內(nèi)，群體間的遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.165 4，明顯低于遠(yuǎn)交物種和多年生物種的平均值（Gst=0.22和Gst=0.19）[19]，表明小果油茶天然的遺傳變異主要集中在群體內(nèi)，群體間存在著一定的遺傳分化，群體間的遺傳變異不顯著。

Hamrick等[20]認(rèn)為基因流Nm大于1，就足以抵制遺傳漂變的作用，同時防止了群體分化的發(fā)生。本試驗(yàn)小果油茶群體物種水平上的基因流（Nm）為2.522 9，表明群體之間存在著比較頻繁的基因交流，有效地阻止了遺傳漂變的發(fā)生，群體之間的遺傳變異不明顯。

小果油茶屬于典型的蟲媒傳粉植物，而且歷史上廣泛分布于長江以南各省，為各群體之間的基因交流提供了有利條件。西南地區(qū)小果油茶分布區(qū)較為集中，主要分布在東經(jīng) 108°～111°，北緯 25°～27°之間，各群體間的地理位置較近，有利于群體間的基因交流，導(dǎo)致西南地區(qū)的小果油茶群體親緣關(guān)系比較相近。

3.2 小果油茶群體的遺傳多樣性特點(diǎn)

運(yùn)用SRAP標(biāo)記對小果油茶6個群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究，通過分析各群體的多態(tài)位點(diǎn)百分率，Nei基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)，確定黎平群體和融水群體的遺傳變異豐富，遺傳變異最低的是全州群體。黎平縣一直是小果油茶的主產(chǎn)區(qū)，當(dāng)?shù)胤N植面積廣，本地農(nóng)家品種豐富，小果油茶群體保護(hù)得較好，加之受外部條件影響較小，因此具有較高的遺傳豐富度。融水群體是西南地區(qū)小果油茶分布緯度較小的群體，當(dāng)?shù)氐男」筒枇謱?shí)行的是粗放式管理，由于經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)，也沒有其他經(jīng)濟(jì)樹種對小果油茶進(jìn)行沖擊，人為因素影響很小，群體豐富的遺傳多樣性得以保存。全州縣毗鄰湖南省，交通較為發(fā)達(dá)，與外省經(jīng)濟(jì)交流也較多。由于油茶效益不高，當(dāng)?shù)卮迕駥⒂筒枇挚撤ゴ云渌?jīng)濟(jì)樹種，全州地區(qū)的小果油茶急劇減少，嚴(yán)重破壞了當(dāng)?shù)匦」筒杌蛸Y源，導(dǎo)致遺傳多樣性降低。

3.3 小果油茶品種選育與保護(hù)策略

自然因素與人為因素造成生境惡劣程度若超過物種對生境適應(yīng)的極限，就會導(dǎo)致該物種遺傳多樣性的喪失[21-22]。小果油茶在中國長江以南各省均有分布，大多數(shù)茶林距今已有30多年的歷史，而且基本上為小果油茶實(shí)生苗繁育，群體遺傳多樣性豐富，對小果油茶的選育提供了良好的條件。但由于環(huán)境的變化，各地林業(yè)部門缺乏保護(hù)，特別是受到其他經(jīng)濟(jì)樹種的沖擊，導(dǎo)致大量小果油茶林被毀，基因資源遭到破壞，遺傳多樣性降低。

種質(zhì)資源保存的主要依據(jù)是種內(nèi)遺傳多樣性，因此了解物種遺傳變異的空間分布格局對于制定科學(xué)的保護(hù)策略具有重要作用。在就地保護(hù)時，除了對所有種群進(jìn)行必要的保護(hù)外，應(yīng)選擇遺傳多樣性程度高的群體進(jìn)行重點(diǎn)保護(hù)。供試的6個群體的Nei基因多樣性指數(shù)在0.318 7～0.381 4之間，表明總體上小果油茶群體具有豐富的遺傳多樣性，其中黎平群體與融水群體的遺傳多樣性最為豐富。在保護(hù)小果油茶種質(zhì)資源時，應(yīng)擴(kuò)大收集范圍，盡量保證其生態(tài)型或地理來源的多樣性，這樣才能最大限度地保護(hù)和利用其遺傳多樣性。

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