龔上佶, 郭夏麗, 羅麗萍, 付宇新, 徐元君, 陳 濱

蜂膠是意大利蜜蜂(Apis mellifera)采集植物芽苞分泌物或傷口處流出的黏液、樹脂等,并混入蜂蠟和其它分泌物經(jīng)咀嚼加工而成的一種黏稠物質(zhì)[1].近些年來研究者對(duì)蜂膠的藥理活性及化學(xué)成分進(jìn)行了全面的研究,發(fā)現(xiàn)蜂膠具有抗菌性、抗病毒、消炎、保肝、抗癌等廣泛的藥理活性[2-5].由于蜂膠具有重要的醫(yī)藥功效,有很廣泛的應(yīng)用價(jià)值,常被做成藥品或保健品.

蜂巢內(nèi)環(huán)境潮濕、溫度適宜、空間狹小,非常適宜微生物的生長(zhǎng),而蜂膠是抑制微生物生長(zhǎng)的“功臣”,具有很強(qiáng)的抑菌性[6].蜂膠作為傳統(tǒng)的醫(yī)藥,使用歷史悠久,但目前對(duì)中國(guó)產(chǎn)蜂膠的基礎(chǔ)研究還比較薄弱,尤其是對(duì)中國(guó)蜂膠的抑菌性研究不多,研究的菌種也非常有限.

為了對(duì)中國(guó)蜂膠抑菌性有較全面的了解,本課題組從中國(guó)不同省份采集29個(gè)蜂膠樣本,研究它們對(duì)9種常見菌種(金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、產(chǎn)氣桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、青霉、曲霉、毛霉和根霉)的抑菌性.通過研究中國(guó)蜂膠醇提物(ethanol extract of propolis,簡(jiǎn)稱EEP)對(duì)這9個(gè)菌種的抑菌圈直徑和最小抑菌濃度,從而直觀且科學(xué)地評(píng)價(jià)中國(guó)蜂膠的抑菌性.并在此基礎(chǔ)上,根據(jù)樣品采集地所屬氣候區(qū)域?qū)?9個(gè)樣品分為5類(高原高寒氣候、溫帶大陸氣候、溫帶季風(fēng)氣候、亞熱帶季風(fēng)氣候和熱帶季風(fēng)氣候),分析了不同氣候區(qū)域EEP的抑菌性差異,從而為我國(guó)蜂膠應(yīng)用研究及蜂膠作為抑菌劑的商品化提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1蜂膠樣品

29種蜂膠樣品分別采自中國(guó)23個(gè)省份,詳細(xì)情況見表1.

表1　不同地區(qū)蜂膠特征[7]Tab.1　Characteristics of propolis from diff erent areas

1.1.2試驗(yàn)菌種

枯草桿菌 (Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、產(chǎn)氣桿菌 (Clostridium perfringens)、大腸桿菌 (Escherichia coli)、變形桿菌(Poteusbacillus vulgaris)、毛霉 (Mucor racemosus)、青霉 (Penicillium glaucum)、曲霉 (Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus nigricans).

1.1.3試劑與儀器

蛋白胨和牛肉膏,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;瓊脂;氯化鈉、葡萄糖(分析純);涂布棒、接種針、酒精燈、超凈工作臺(tái),蘇凈集團(tuán)安泰公司(SWCJ- 2FD);GZX -DH.600--S--II型恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠.

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蜂膠樣品前處理

將蜂膠樣品置于-18℃條件下冷凍,變硬變脆后打成小碎塊,去除雜質(zhì),用藥材粉碎機(jī)粉碎并用1.18 mm的網(wǎng)目過濾,混勻后放于冰箱中備用.

1.2.2蜂膠醇提物的制備

取1 g蜂膠粉末,用60%乙醇溶液按固液比1∶20在35℃提取4 h后過濾,再用相應(yīng)濃度乙醇分3次沖洗過濾,濾液于50℃真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥,得到固態(tài)的EEP,置于-18℃中保存?zhèn)溆?使用時(shí),用乙醇復(fù)溶,配制成20 mg·mL-1的溶液.

1.2.3培養(yǎng)基的制備[8]

肉湯培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g,加雙蒸水至1 000 mL,調(diào)至pH 7.2～7.6.

真菌培養(yǎng)基:蛋白胨 10 g、葡萄糖 40 g、加雙蒸水至1 000 mL,調(diào)至pH 7.1.

1.2.4抑菌圈的測(cè)定

采用瓊脂稀釋法測(cè)定抑菌圈[9].配制濃度為1.5×108個(gè)·mL-1的菌懸液,用5.0麥?zhǔn)媳葷岱ㄐＵ?將200μL的菌種懸濁液加入到固體培養(yǎng)基上,細(xì)菌使用肉湯培養(yǎng)基,真菌使用真菌培養(yǎng)基.無(wú)菌濾紙圓片(D=5.5 mm)加7μL EEP后,均勻貼在上述培養(yǎng)基上.在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(細(xì)菌24 h,真菌培養(yǎng)48 h),測(cè)量并記錄抑菌圈直徑,每個(gè)菌種重復(fù)3次.

1.2.5最小抑菌濃度的測(cè)定[10]

將EEP母液稀釋成不同濃度,加于含有等量菌懸濁液的96孔的平板內(nèi),混合均勻,然后將平板放在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(細(xì)菌24 h,真菌48 h),觀察試驗(yàn)菌生長(zhǎng)情況,以不長(zhǎng)菌的最小EEP濃度(mg·mL-1)為最小抑菌濃度.

2　結(jié)果與討論

2.1　各地蜂膠對(duì)9個(gè)菌種的抑菌圈直徑和最小抑菌濃度

各地蜂膠對(duì)9個(gè)菌種的抑菌圈直徑和最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.抑菌圈直徑和最小抑菌濃度進(jìn)行相關(guān)性分析,呈負(fù)相關(guān)顯著,說明抑菌圈越大,最小抑菌濃度越小,抑菌性越大.

表2　不同地區(qū)蜂膠醇提物的抑菌圈直徑(mm)和最小抑菌濃度(mg·g-1)Tab.2　Zones of inhibition of EEP from different areas(mm)and MIC(mg·g-1)

2.2　不同氣候區(qū)域EEP對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌性

不同氣候區(qū)域EEP,對(duì)枯草桿菌的抑菌圈(mm,以下單位相同)平均為:高原高寒(14.2)＞溫帶大陸(13.6)＞溫帶季風(fēng)(12.9)＞亞熱帶季風(fēng)(11.6)＞熱帶季風(fēng)(9.7);對(duì)金黃色葡萄球菌的平均抑菌圈直徑基本沒有差異,抑菌圈分別為:9.43(溫帶大陸)、9.42(溫帶季風(fēng))、9.37(亞熱帶季風(fēng))、9.31(高原高寒)和9.25(熱帶季風(fēng));對(duì)產(chǎn)氣菌的平均抑菌圈為:溫帶季風(fēng)(9.35)＞溫帶大陸(8.93)＞亞熱帶季風(fēng) (8.89)＞高原高寒 (8.74)＞熱帶季風(fēng)(8.26).

上述結(jié)果表明:不同氣候區(qū)域EEP對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌都具有較好的抑菌性,而對(duì)枯草桿菌的抑菌性最強(qiáng).

2.3　不同氣候區(qū)域EEP對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌性

不同氣候區(qū)域EEP對(duì)大腸桿菌的平均抑菌圈為:溫帶大陸 (10.41)＞高原高寒 (10.35)＞溫帶季風(fēng)(10.22)＞亞熱帶季風(fēng) (10.19)＞熱帶季風(fēng)(8.47);對(duì)變形桿菌的平均抑菌圈為:亞熱帶季風(fēng)(8.09)＞溫帶季風(fēng)(7.78)＞溫帶大陸(7.63)＞高原高寒(6.94)＞熱帶季風(fēng)(6.88).

上述結(jié)果表明:不同氣候區(qū)域EEP對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌性沒有對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌強(qiáng),特別是對(duì)變形桿菌的抑菌性很弱;不同的氣候區(qū)域中,熱帶季風(fēng)EEP的抑菌性最弱.

2.4　不同氣候區(qū)域EEP對(duì)真菌的抑菌性

不同氣候區(qū)域EEP對(duì)毛霉的平均抑菌圈為:溫帶大陸 (11.13)＞溫帶季風(fēng)(10.96)＞高原高寒(10.63)＞亞熱帶季風(fēng)(9.95)＞熱帶季風(fēng)(8.32);對(duì)青霉的平均抑菌圈為:高原高寒(10.72)＞溫帶大陸 (10.67)＞亞熱帶季風(fēng)(9.96)＞溫帶季風(fēng)(9.84)＞熱帶季風(fēng) (8.18);對(duì)曲霉的平均抑菌圈直徑為:高原高寒(11.75)＞溫帶季風(fēng)(11.62)＞溫帶大陸(10.39)＞亞熱帶季風(fēng)(9.84)＞熱帶季風(fēng)(9.25);對(duì)根霉的平均抑菌圈直徑大小為:高原高寒(13.56)＞亞熱帶季風(fēng)(11.83) ＞溫帶大陸(11.98)＞溫帶季風(fēng)(10.82)＞熱帶季風(fēng)(10.46).

上述結(jié)果表明,中國(guó)不同氣候區(qū)域EEP對(duì)真菌有較強(qiáng)的抑菌性.從氣候區(qū)域來看,高原高寒EEP具有很好的抑菌性,而熱帶季風(fēng)EEP對(duì)真菌的抑菌性明顯弱于其他氣候區(qū)域.

2.5　不同地區(qū)EEP對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的抑菌性比較

不同地區(qū)EEP對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的平均抑菌圈為9.88 mm±1.47 mm,對(duì)革蘭氏陰性菌的平均抑菌圈為8.75 mm±1.56 mm,對(duì)真菌的平均抑菌圈為10.01 mm±0.65 mm,可見中國(guó)不同地區(qū)EEP對(duì)真菌的抑菌性最強(qiáng),其次為革蘭氏陽(yáng)性菌,對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌性最弱.在這9個(gè)菌種中,對(duì)變形桿菌的抑菌性最差,對(duì)根霉的抑菌性最好.

Dixon[11]認(rèn)為蜂膠對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌性弱是因?yàn)榉淠z中的主要成分是植物的分泌物,而植物多受革蘭氏陽(yáng)性菌的侵害,因此植物分泌的物質(zhì)大多是保護(hù)植物免受對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的危害.還有一種理論由Bendel[12]提出,他認(rèn)為蜜蜂的巢穴容易受一種瓦螨類寄生蟲的侵害,而這種寄生蟲是一種革蘭氏陽(yáng)性菌,因此對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌性更強(qiáng).

3　結(jié) 論

1)中國(guó)不同地區(qū)EEP對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都具有較好的抑菌性.對(duì)真菌的抑菌性最強(qiáng),其次為革蘭氏陽(yáng)性菌,對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌性最弱.在文中所用9個(gè)菌種中,對(duì)變形桿菌的抑菌性最差,對(duì)根霉的抑菌性最好.

2)溫帶EEP抑菌性最強(qiáng),亞熱帶EEP次之,而熱帶EEP最弱.不同氣候區(qū)域蜂膠的EEP抑菌性沒有顯著差異.