王紅莉，蒙嘉文，羅建勛* ，王朱濤，蔡應(yīng)君，任樹平

(1.四川省林科院，四川 成都 610081;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川 雅安 625014;3.若爾蓋縣林業(yè)局，四川 若爾蓋 624500)

康定柳(Salix ParaplesiaSchneid)是楊柳科(Salicaceae)柳屬(Salix)落葉小喬木或灌木，為川西北高原特有鄉(xiāng)土樹種。近年來廣泛用于該地區(qū)防沙治沙，該樹種為雌雄異株，天然更新容易，群體內(nèi)雌雄個體數(shù)量相當(dāng)。為選出優(yōu)良防沙治沙種植材料，馮毅等［1］分別了研究5個群體遺傳多樣性。

簡單重復(fù)序列(SSR，Simple Sequence Repeat)也稱微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)或短串聯(lián)重復(fù)(Short Tandem Repeat，STR)，是近年來發(fā)展起來的基于PCR技術(shù)的一種新的分子標(biāo)記技術(shù)，同時，作為一種基于DNA長度多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)。SSR由2～4個多次串聯(lián)重復(fù)的核苷酸組成，廣泛分布于真核生物的基因組中［2］。SSR分子標(biāo)記因具有共顯性遺傳、高度多態(tài)性、重復(fù)性和穩(wěn)定性好、易于實現(xiàn)自動化等優(yōu)點［3］。在遺傳和物理圖譜構(gòu)建、基因定位、遺傳多樣性和物種進(jìn)化分析、親緣關(guān)系鑒定、DNA指紋圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)、分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面有著廣泛的應(yīng)用前景［4～6］。

SSR引物開發(fā)工作量大，操作復(fù)雜，并且需要了解一定的基因組序列信息，有研究表明:從一個基因組中分離出來的SSRs可以用于同科、同屬中其它個體［7，8］。這樣一來，不僅大大降低了開發(fā)成本，并且也使得SSR技術(shù)在種質(zhì)資源的研究方面得到更廣泛的應(yīng)用。本實驗以川西高原地區(qū)特有的鄉(xiāng)土樹種——康定柳為材料，在楊樹基因組SSR標(biāo)記中篩選引物，分析其引物通用性，為下一步在DNA分子水平上通過SSR分子標(biāo)記探求康定柳雌雄群體間/內(nèi)遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化，為生產(chǎn)上使用雌雄群體或混合群體防沙治沙遺傳穩(wěn)定性和成效提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所采用的康定柳的5個群體分別來自四川省的紅原、若爾蓋紅星、阿壩、巴西和壤塘。每個群體采集雌雄單株各20株，共計200個個體。

本實驗采用的622對SSR引物來源于楊樹SSR數(shù)據(jù)庫Populusmolecular genetics cooperative(http://www.ornl.gov/sci/ipgc/ssr_resource.htm)隨機(jī)抽取合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 康定柳基因組DNA的提取

采取CTAB法提取康定柳新鮮葉片的基因組DNA［9］。將其濃度最終定為 50 ng·μl－1～ 100 ng·μl－1。

1.2.2 PCR 反應(yīng)及產(chǎn)物檢測

從5個群體中隨機(jī)選取兩個個體，用622對引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

在以上能擴(kuò)增出條帶的引物的基礎(chǔ)上，分別從5個群體的雌雄群體中各隨機(jī)抽取一個樣，共計10個個體，進(jìn)一步進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系為:20 μl體系，DNA模板 0.5 μl，rTaqDNA 聚合酶 0.2 μl，10 × PCR buffer 2.0 μl，dNTPs 0.8 μl，上下游引物各 1.0 ul，滅菌蒸餾水14.5 μl。

PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性3 min;30個循環(huán)(95℃ 變性 30 s，57℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s);72℃延伸10 min;4℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙錠(EB)染色后對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩

從5個群體中隨機(jī)選取兩個個體(來自不同群體的雌雄株)，用622對引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

622對引物對隨機(jī)選取的引物擴(kuò)增情況見表1。

表1 初篩引物統(tǒng)計表

其中兩對樣品都能擴(kuò)增出來的有105對，占實驗總數(shù)的16.88%。

初步篩選中，引物可利用率達(dá)到16.88%。部分引物擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 兩個樣品部分引物擴(kuò)增結(jié)果

2.2 復(fù)篩

在以上能擴(kuò)增出條帶的引物的基礎(chǔ)上，分別從5個群體的雌雄群體中各隨機(jī)抽取一個樣，減去初篩時取過的2個群體的個體，共計8個個體，進(jìn)一步進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

上一步中篩選出的105對引物對隨機(jī)選取的8個個體擴(kuò)增結(jié)果見表2。

表2 復(fù)篩引物統(tǒng)計表

其中8個個體都能擴(kuò)增出清晰條帶的有49對引物，占復(fù)篩引物總數(shù)的46.67%。

復(fù)篩選中，引物可利用率達(dá)到7.88%。部分引物擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

3 結(jié)論

圖2 8個樣品部分引物擴(kuò)增結(jié)果

從來自楊樹基因組的622對引物對與其同科不同屬的康定柳的擴(kuò)增結(jié)果來看，引物的擴(kuò)增成功率為7.88%。雖然概率比較低，但是最終得到的49對引物對所有代表性的樣品都可以穩(wěn)定地擴(kuò)增出清晰的條帶，因而其引物可以在該物種的SSR分析中通用。

通用性引物的存在能夠有效地彌補(bǔ)物種分子標(biāo)記的不足，豐富標(biāo)記數(shù)量［10］。本研究在楊柳科中的康定柳這一川西高原特有的柳樹品種中證實了楊樹基因組SSR標(biāo)記在該樹種中的通用性。這對進(jìn)一步從分子水平上研究康定柳的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳分化和構(gòu)建遺傳圖譜等具有重要的學(xué)術(shù)和應(yīng)用價值。

［1］ 馮毅，羅建勛，等.川西北地區(qū)康定柳天然群體表型多樣性研究［J］。西南林學(xué)院學(xué)報，2010，30(4):11 ～15.

［2］ Litt M，and Luty J A.A hypervariable microsatellite revealed byin vitroamplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene，Am J Hum Genet，1989，44:397 ～401.

［3］ Powell W，Machray G C，and Provan J.Polymorphism revealed by simple sequence repeats.Trends in Plant Science，1996，1(7):215～222.

［4］ Tuskan G A，Gunter L E，Yang Z K，et al.Characterization of microsatellites revealed by genomic squencin ofPopulus trichocarpa，Can.J.For.Res.，2004，34:85 ～93.

［5］ Varshney R K，Graner A，and Sorrells M E.Genic microsatellite markers in plants:features and applications.T rends in Biotechnology，2005，23(1):48 ～55.

［6］ Yin T M，DiFazio S P，Gunter L E，et al.Genome structure and emerging evidence of an incipient sex chromosome inPopulus.Genome Res，2008，18:422 ～430.

［7］ Kijas J M H，F(xiàn)owler J C S，Thomas M R.An evaluation of sequence tagged microsatellite site marker for genetic analysis withinCitrusand related species.Genome，1995，38:349 ～355.

［8］ Peakall R，Gilmore S，Keys W，Morgante M，Rafalski A.Cross-species amplification of soybean(Glycine max)simple sequence repeats(SSRs)within the genus and other legume genera.Mol.Biol.Evol，1998，15:1275 ～1287.

［9］ Doyle J J，and Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue，Phytochemistry Bulletin，1987，19:11～15.

［10］ 李宏偉，劉曙東，高麗鋒，等.小麥EST－SSRs的通用性研究［J］.植物遺傳資源學(xué)報，2003，4(3):252～255.