王彩娟，藺銀鼎，王 凱，賈清芳

(1.聞喜縣林業(yè)局，山西 聞喜 043800;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西 太谷 030801;3.山西省呂梁山國(guó)有林管理局，山西 臨汾 041000)

秋色葉植物葉片著色與酶活性關(guān)系的研究

王彩娟1，藺銀鼎2，王 凱1，賈清芳3

(1.聞喜縣林業(yè)局，山西 聞喜 043800;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西 太谷 030801;3.山西省呂梁山國(guó)有林管理局，山西 臨汾 041000)

以元寶楓、火炬、爬山虎3種秋色葉植物為試材，研究了秋葉變色時(shí)期葉片花青苷的含量與超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)及多酚氧化酶(PPO)活性的動(dòng)態(tài)變化及相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明:3種秋色葉植物花青苷的含量決定葉片的著色程度。3種秋色葉植物花青苷含量隨葉片著色呈上升趨勢(shì)，火炬和爬山虎花青苷的上升速率比元寶楓快。SOD活性隨著葉片著色逐漸下降，與花青苷含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明其在一定程度上不利于秋色葉植物葉片著色。POD活性表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，3種植物中POD活性與花青苷相關(guān)性不一。PPO活性隨葉片著色而逐漸上升，與花青苷含量呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明PPO是秋色葉植物葉片變色過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一。

秋色葉植物;葉片著色;花青苷;超氧化物歧化酶;過(guò)氧化物酶;多酚氧化酶

彩葉植物具有一般綠色植物所不具備的絢麗多彩的葉色，近年來(lái)，在園林綠化中備受重視，應(yīng)用廣泛。筆者以元寶楓、火炬和爬山虎3種紅色類秋色葉植物為試材，通過(guò)比較3種植物葉片呈色的差異，研究了秋葉變色期間葉片中花青苷、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性變化規(guī)律及其相互關(guān)系，以期找出控制葉色表達(dá)的關(guān)鍵酶，為秋色葉植物改良葉色提供廣闊的前景和全新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)地選在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院園林植物資源圃內(nèi)，年均溫9.5℃，年均降水量450 mm．以苗圃內(nèi)元寶楓(Acer truncatumBunge．)、火炬(Rhus typhinaL．)和爬山虎［Parthenocissus tricuspidata(Sieb．et Zucc．)Planch．］3種秋色葉植物為供試植物。于2008年9月至11月，每6 d采集1次植物葉片測(cè)定其花青苷含量、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性以及多酚氧化酶活性。此外，觀察并記錄3種植物樣株中葉片變色時(shí)間及變色數(shù)量(用紅葉數(shù)量所占全株葉片數(shù)量的百分比來(lái)表示)。

1.2 方法

1.2.1 花青苷的提取與測(cè)定

稱取0.2 g新鮮葉片，加入1%鹽酸乙醇提取液置于 32℃恒溫箱中提取 4 h，10 000×g離心10 min，以1%鹽酸乙醇提取液為對(duì)照。用分光光度計(jì)測(cè)定520 nm的吸光度值(OD)。

1.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定

稱取0.1 g新鮮葉片，加入1 mL 50 mmol磷酸緩沖液(pH 7.8)，冰上研磨后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，12 000 rpm冷凍離心15 min，取上清液供酶活性測(cè)定。取50 μL酶液加入6 mL氮藍(lán)四唑(NBT)反應(yīng)液，在25℃下光照20 min，以保存于暗處的NBT反應(yīng)液為對(duì)照，在560 nm波長(zhǎng)下比色，以抑制NBT光化還原的50%為1個(gè)酶活力單位。

1.2.3 過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定

稱取0.3 g新鮮葉片加入1.5 mL 0.1 mol Tris-HCl緩沖液(pH 8.5)，研磨成勻漿，以4 000 rpm離心15 min，上清液即為酶提取液。取200 μL酶液加入0.1 mol磷酸緩沖液(pH 6.0)3 mL，并以0.1 mol磷酸緩沖液為參比，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，在470 nm處測(cè)定吸光度值。反應(yīng)3 min后，再在470 nm處測(cè)定吸光度值。以每分鐘內(nèi)470 nm的吸光度值變化0.01為1個(gè)過(guò)氧化物酶活力單位。

1.2.4 多酚氧化酶(PPO)活性測(cè)定

取0.2 g新鮮葉片，加3 mL 0.03 mol的磷酸緩沖液(pH 5.5)，冰浴研磨，10 000×g離心10 min，上清液即為酶提取液。取0.5 mL酶液，加入2 mL磷酸緩沖液和1 mL 0.1 mol兒茶酚溶液(新配)，35℃保溫15 min，在525 nm下測(cè)定OD值，以吸光度值改變0.01為1個(gè)酶活力單位。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析方法

用Microsoft Office Excel和Spss 11.5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種植物葉片變色觀測(cè)結(jié)果分析

以3種植物樣株中紅葉數(shù)量占葉片總數(shù)量的百分比來(lái)表示植物葉片的變色情況，結(jié)果見(jiàn)圖1．

圖1 3種秋色葉植物變色情況比較

從圖1中可以看出，元寶楓的變色時(shí)間明顯晚于爬山虎和火炬。爬山虎和火炬在9月23日左右開(kāi)始變色，變色比例分別達(dá)到20%和10%．而元寶楓在10月6日才開(kāi)始變色，變色比例達(dá)到10%．隨著時(shí)間的推移，3種植物的變色比例逐漸增大，爬山虎和火炬在10月13日基本達(dá)到全部變色，而元寶楓到10月19日才全部變色。其中元寶楓的變化速率最快，說(shuō)明其呈色時(shí)間最短。另外，據(jù)田間觀測(cè)得知，元寶楓葉片變色時(shí)間晚于火炬和爬山虎，落葉卻早于二者，說(shuō)明元寶楓秋葉觀賞期較短。

2.2 3種植物葉片中花青苷含量的變化

3種秋色葉植物葉片中花青苷含量的變化如圖2所示。

圖2 3種秋色葉植物葉片中花青苷含量的比較

由圖2可以看出，在變色過(guò)程中3種秋色葉植物葉片的花青苷含量均呈逐漸上升趨勢(shì)。在整個(gè)過(guò)程中元寶楓葉片的花青苷含量低于其它二者，且花青苷合成時(shí)間晚于火炬和爬山虎?；鹁婧团郎交⑷~片的花青苷含量從9月17日開(kāi)始上升，到10月6日達(dá)到高峰，花青苷含量的增幅分別達(dá)到172.38%和228.41%．元寶楓葉片的花青苷含量從9月30日開(kāi)始上升，到10月13日達(dá)到最大值，增幅為141.74%．3種植物花青苷含量的變化趨勢(shì)與田間觀測(cè)結(jié)果一致。

2.3 3種植物超氧化物歧化酶活性的變化

超氧化物歧化酶與花青苷的合成關(guān)系密切，花青苷也具有很強(qiáng)的抗氧化功能。3種秋色葉植物在葉色變化過(guò)程中SOD活性的變化如圖3.

圖3 3種秋色葉植物葉片SOD活性的比較

由圖3分析可知，3種秋色葉植物變色過(guò)程中葉片的SOD活性變化趨勢(shì)基本相同，均呈下降趨勢(shì)。前期下降幅度明顯大于后期，且火炬的SOD活性最低，元寶楓的SOD活性最高。在9月上旬，樹(shù)體營(yíng)養(yǎng)相對(duì)均衡，各方面代謝調(diào)整到了較好狀態(tài)。因此，樹(shù)體內(nèi)的自由基含量比較少且穩(wěn)定，自由基及其衍生物對(duì)樹(shù)體不能構(gòu)成傷害或傷害很小，此時(shí)SOD活性變化不大。而到9月中旬，葉片逐漸變色，自由基含量明顯增加，再加上外界自然環(huán)境的影響，使樹(shù)體自身調(diào)節(jié)系統(tǒng)的平衡逐漸被打破。所以，SOD活性在這一時(shí)期下降。9月下旬到10月上旬，SOD活性比較穩(wěn)定，之后又急劇下降。這是由于在變色末期(10月中、下旬)葉片衰老的不可逆性，體內(nèi)自由基及其衍生物大量積累，超過(guò)了自身防御系統(tǒng)的清除能力，并且積累的自由基及其衍生物能夠?qū)е旅附Y(jié)構(gòu)損傷，從而使植物體內(nèi)的酶活性降低。整個(gè)過(guò)程中，火炬 SOD活性下降幅度最大，達(dá)84.14%，元寶楓和爬山虎的下降幅度分別為65.11%和72.76%．

2.4 3種植物過(guò)氧化物酶活性的變化

3種秋色葉植物葉片中POD活性的變化如圖4．

圖4 3種秋色葉植物葉片POD活性的比較

由圖4可知，3種秋色葉植物葉片POD活性變化在整個(gè)過(guò)程中呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，POD活性在10月上旬(10月6日左右)達(dá)到最高值。其中，元寶楓的POD活性上升最快，且活性大于火炬和爬山虎。

從變化趨勢(shì)分析，SOD與POD在樹(shù)體內(nèi)具有協(xié)同作用。變色前期植物體內(nèi)的自由基含量少，POD活性較小，但SOD活性較高，說(shuō)明各變色時(shí)期對(duì)消除自由基起主要作用的酶不同，這是植物自身調(diào)節(jié)的結(jié)果。在變色期，體內(nèi)自由基及其衍生物的含量不斷增加，需要大量的POD來(lái)分解H2O2，隨著葉片逐漸衰老，POD活性又減小;另一方面，變色期POD活性的增加也可能是用來(lái)分解葉綠素和生長(zhǎng)素，使樹(shù)體盡早停止生長(zhǎng)，減少營(yíng)養(yǎng)消耗，從而增強(qiáng)樹(shù)體抵抗自由基及其衍生物和外界自然環(huán)境造成傷害的能力。

2.5 3種植物多酚氧化酶活性的變化

多酚氧化酶廣泛存在于植物葉片和果實(shí)中，是以銅元素作為輔基的一種蛋白，是引起植物葉片、果實(shí)發(fā)生酶促褐變的主要酶。3種秋色葉植物葉片PPO活性的變化如圖5.

圖5 3種秋色葉植物葉片PPO活性的比較

由圖5可以看出，3種秋色葉植物葉片的PPO活性變化隨著葉色轉(zhuǎn)變均呈上升趨勢(shì)。其中，爬山虎和火炬的葉片PPO活性較高，元寶楓較低。這與田間觀測(cè)結(jié)果相對(duì)應(yīng)，即火炬和爬山虎葉片呈色要好于元寶楓，表明PPO活性可促進(jìn)葉片著色。PPO活性變化在不同樹(shù)種間差異較大，且在整個(gè)過(guò)程中持續(xù)變化，說(shuō)明PPO活性對(duì)葉片的著色起到重要作用。

2.6 3種植物葉片花青苷含量與酶活性的相關(guān)性

3種秋色葉植物葉片花青苷含量與SOD，POD及PPO活性的相關(guān)關(guān)系見(jiàn)表1.

表1 3種植物葉片花青苷含量與酶活性的相關(guān)性

花青苷是促使3種秋色葉植物葉片顯現(xiàn)紅色的主要色素，葉片中SOD，POD和PPO 3種酶活性與花青苷的相關(guān)性從一定程度上可以反映出其在秋色葉植物葉色轉(zhuǎn)變中的作用機(jī)制。由表1可見(jiàn)，3種秋色葉植物葉片中花青苷與PPO活性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，3種植物的相關(guān)性差異不大。PPO是催化種皮中多酚類化合物氧化形成花青苷的重要酶，如表1中所示，它也是秋色葉植物葉片變色過(guò)程中的關(guān)鍵酶。3種植物花青苷與SOD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。爬山虎和元寶楓的花青苷與POD活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，火炬的花青苷與POD活性呈不顯著的正相關(guān)關(guān)系。試驗(yàn)表明，SOD活性在一定程度上不利于秋色葉植物葉片的著色。

3 結(jié)論

1)根據(jù)田間觀測(cè)可知，葉色轉(zhuǎn)變過(guò)程中火炬和爬山虎葉片呈色要好于元寶楓?；鹁婧团郎交⑷~片變色開(kāi)始時(shí)間早于元寶楓，而落葉時(shí)間晚于元寶楓，說(shuō)明火炬和爬山虎的秋葉觀賞期比元寶楓長(zhǎng)。

2)在秋葉變色過(guò)程中，3種植物葉片中花青苷含量隨葉片著色呈上升趨勢(shì)。與田間葉色觀測(cè)相結(jié)合可知，秋色葉植物葉片著色程度取決于花青苷的含量。

3)3種秋色葉植物的SOD活性在整個(gè)過(guò)程中持續(xù)下降，POD活性表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。SOD活性與花青苷含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明其在一定程度上阻礙了花青苷的合成，不利于秋色葉植物葉片著色。POD活性與爬山虎、元寶楓的花青苷含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與火炬呈不顯著的正相關(guān)關(guān)系。

4)3種秋色葉植物葉片PPO活性隨葉色變紅而逐漸上升，與花青苷含量呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系。PPO活性的高低在不同樹(shù)種間差異較大，在變色期元寶楓的PPO活性極顯著低于火炬和爬山虎。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明PPO是秋色葉植物葉片變色過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一。

4 討論

1)PPO活性升高可對(duì)植物起到保護(hù)作用。試驗(yàn)中PPO活性隨花青苷含量升高而逐漸升高，二者呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系。說(shuō)明PPO活性對(duì)花青苷合成起到重要作用，PPO是秋色葉植物葉片變色過(guò)程中的關(guān)鍵酶。

2)在整個(gè)變色期，3種秋色葉植物葉片內(nèi)的SOD，POD活性變化趨勢(shì)在品種間無(wú)明顯差異，隨物候期呈現(xiàn)出相同的變化規(guī)律。然而3種植物的抗氧化酶活性高低存在差異，說(shuō)明抗氧化酶活性在一定程度上阻礙了花青苷的合成，這與陳俊意的研究結(jié)果一致。從變化趨勢(shì)分析，SOD與POD在樹(shù)體內(nèi)具有協(xié)同作用，SOD活性在整個(gè)過(guò)程中持續(xù)下降，POD活性先升后降，這是因?yàn)樽兩捌谥参矬w內(nèi)的自由基含量少，變色開(kāi)始后，體內(nèi)自由基及其衍生物的含量不斷增加，需要分解大量的H2O2，而不同酶對(duì)消除自由基起的作用不同，這是植物自身調(diào)節(jié)的結(jié)果。花青苷具有很強(qiáng)的抗氧化功能，抗氧化酶和花青苷在植物抗氧化過(guò)程中都起到重要作用，可能具有一定的互補(bǔ)關(guān)系。

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Study on the Relation between Leaf Coloring and Enzymes Activity in Different Fall-leaf Plants

Wang Caijuan1，Lin Yinding2，Wang Kai1，Jia Qingfang3
(1.Wenxi Forestry Bureau，043800 Wenxi，China;2.Shanxi Agricultural University，030801 Taigu，China;3.Stated Forestry Administrative Bureau of Lüliang Mountains，041000 Linfen，China)

Three kinds of fall-leaf plant Acer truncatum Bunge，Rhus typhina Linn and Parthenocissus quinquefolia Planch were used as the materials，the changes of anthocyanin content and the activities of SOD，POD，PPO were dynamically investigated at leaf coloring stages，and the relationship between them was also studied．The results showed that:the anthocyanin content of three kinds of fall-leaf plant determined the leaves coloring degree．The anthocyanin content in three fall-leaf plants tended upwards in line with the process of leaves coloring，the synthesis rate of anthocyanin in Rhus typhina and Parthenocissus tricuspidata ascended faster than Acer truncatum Bunge．The SOD activity showed a drop tendency in the process of color transformation，and the SOD activity was strongly negatively relative with anthocyanin content，suggesting that the SOD activity is not conducive to leaves coloring of fall-leaf plant．The POD activity showed an increasing at first，then showed a decreased tendency，and the relativity between the POD activity and anthocyanin content is different among three kinds of fall-leaf plant．The PPO activity rises along with the color changes and is strongly positively relative with anthocyanin content，further illustrating that the PPO activity plays an important role in the process of leaves coloring of fall-leaf plant．

Fall-leaf plant;leaf coloring;anthocyanin;superoxide dismutase;peroxidase;polyphenol oxidase

S687

A

1007-726X(2011)04-0006-04

2011-09-11

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(041038)

王彩娟(1984— )，女，山西聞喜人，2009年畢業(yè)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，助理工程師。

藺銀鼎(1955— )，男，山西臨汾人，主要從事園林植物生理生態(tài)研究，教授。