李彥博，孫 靜

蓮須為睡蓮科植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn.)的干燥雄蕊。味甘、澀，性平，歸心、腎經(jīng)，具有固腎澀精之功效。主要成分為木犀草素、槲皮素、異槲皮苷、山柰素等黃酮類化合物［1］?！吨袊幍洹罚?］僅收載顯微鑒別，無含量測定標(biāo)準(zhǔn)。本文首次采用HPLC法建立蓮須中木犀草素的含量測定方法，為控制蓮須藥材的質(zhì)量提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，Waters二極管陣列檢測器(PDA 2996)，Waters Empower色譜工作站，UV-2401PC紫外分光光度計(日本島津)，sartorius電子天平。木犀草素對照品購自中國藥品生物制品檢定所(批號:111520-200504);甲醇為色譜純;水為純凈水;其余試劑均為分析純。蓮須樣品經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)石俊英教授鑒定為睡蓮科植物蓮的干燥雄蕊。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex-C18(4.6mm ×250mm，5μm);流動相:甲醇-0.2%磷酸溶液(55∶45);檢測波長:350 nm;PDA色譜峰光譜采集范圍:300～400 nm;流速:1.0mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL;理論塔板數(shù)按木犀草素峰計算應(yīng)不低于2500。

2.2 檢測波長的選擇 取木犀草素對照品適量，用甲醇溶解，照紫外-可見分光光度法，在200～400 nm之間掃描，木犀草素在350 nm處有最大吸收，且峰形良好，故確定檢測波長為350 nm。

2.3 供試品溶液色譜峰純度檢查 由于中藥材無法制備陰性對照溶液，故選用二極管陣列檢測器對供試品溶液色譜峰純度進(jìn)行檢查。實驗結(jié)果顯示，供試品溶液與對照品溶液在木犀草素保留時間處的光譜圖完全一致，表明供試品溶液在木犀草素保留時間處無其他干擾雜質(zhì)。

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取木犀草素對照品(五氧化二磷干燥器中減壓干燥48 h)10.2 mg，用甲醇溶解并定容至100mL，作為木犀草素對照品儲備液(濃度為0.102 mg/mL)。分別精密量取木犀草素對照品儲備液 1、2、4、8、10mL，用甲醇溶解并定容至10mL，作為5個濃度的木犀草素對照品溶液。分別精密吸取20μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以木犀草素進(jìn)樣量C為橫坐標(biāo)、吸收峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程:A=3744608 C-34106(r=0.9997)。表明木犀草素在 0.204μg～ 2.040μg之間與吸收峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度實驗 取同一木犀草素對照品溶液(濃度為0.0408 mg/mL)，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定，吸收峰面積分別為3054041、3033706、3053315、3046547、3020652，平均為3041652，RSD=0.47%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，分別于制備0、1、2、4、6 h 后測定，吸收峰面積分別為1829629、1825177、1818354、1812158、1806-626，平均為1818389，RSD=0.51%。表明供試品溶液在制備后6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實驗 取同一樣品，平行制備5份供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算含量，結(jié)果分別為 0.0419%、0.0422%、0.0415%、0.0421%、0.0417%，平均為0.0419%，RSD=0.68%。表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量(0.0423%)的樣品6份，分別精密加入一定量木犀草素對照品，按樣品測定方法處理，測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。木犀草素的平均加樣回收率為99.44%，RSD=0.82%。表明測定方法準(zhǔn)確、可靠。

表1 木犀草素含量測定加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測定 取樣品粉末2 g，精密稱定，精密加入甲醇50mL，稱定重量，回流提取2 h，放冷，用甲醇補足損失的重量，濾過，取續(xù)濾液，用0.45μm的微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，結(jié)果見圖1、表2。

圖1 木犀草素含量測定高效液相色譜圖

表2 蓮須中木犀草素含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 實驗過程中，筆者從提取方法、提取溶媒、提取時間3個方面對供試品溶液的制備方法進(jìn)行了優(yōu)化篩選。實驗結(jié)果表明，回流提取的效率高于超聲提取，以甲醇為溶媒提取效果優(yōu)于乙醇;分別以1 h、2 h、3 h為提取時間的研究結(jié)果顯示，2 h木犀草素溶出即達(dá)到平衡，2 h以后，延長提取時間，測得木犀草素含量不再增加，故確定供試品溶液的制備方法為甲醇回流提取2 h。

3.2 實驗結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的蓮須樣品中木犀草素含量有一定差異。其中浙江杭州產(chǎn)的蓮須木犀草素含量最高，達(dá)0.0844%;河北保定產(chǎn)的蓮須木犀草素含量最低，為0.0404%。前者高出后者一倍多。

3.3 HPLC法測定蓮須中木犀草素的含量，操作簡便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，加樣回收率高，可以用于蓮須的質(zhì)量控制，填補《中國藥典》蓮須項下無含量測定的空白。

［1］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典.下冊［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006:2501.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:257.