曾正明，況浩池，羅俊濤，陳光珍，付均，楊揚，何興材

（四川農(nóng)科院水稻高粱研究所，國家水稻改良中心瀘州分中心，四川 德陽 618000)

分子標(biāo)記輔助選擇Pi9（t)基因培育雜交稻抗稻瘟病恢復(fù)系

曾正明，況浩池，羅俊濤，陳光珍，付均，楊揚，何興材

（四川農(nóng)科院水稻高粱研究所，國家水稻改良中心瀘州分中心，四川 德陽 618000)

水稻抗稻瘟病基因Pi9（t)抗譜廣、抗性強。以攜帶抗稻瘟病基因Pi9（t)的小粒野生稻Oryzaminuta為抗源，以優(yōu)良雜交稻恢復(fù)系瀘恢17和瀘恢602為受體親本，通過雜交和復(fù)交，在分離群體中利用與Pi9（t)緊密連鎖的標(biāo)記PB8進行分子標(biāo)記輔助選擇，結(jié)合農(nóng)藝性狀選擇，獲得5份目標(biāo)基因純合且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的恢復(fù)材料。以四川近年來具有代表性的32個菌株對這5份材料進行抗性鑒定，其抗性頻率達(dá)81.25%～87.50%;并對這5份材料進行了耐高溫鑒定及配合力測定，最終培育出抗性較強、耐熱、配合力較高的優(yōu)良恢復(fù)系R102、R105。

分子標(biāo)記輔助選擇;抗稻瘟基因Pi－ 9;恢復(fù)系

水稻（OryaasativaL.)是我國重要的糧食作物，我國水稻常年栽培面積三千萬公頃以上，產(chǎn)量居糧食作物首位。稻瘟病是由Pyricularia OryzaeCav引起的真菌性病害，全國水稻種植區(qū)均有發(fā)生，在流行年份，稻瘟病造成的產(chǎn)量損失一般為10%～20%，嚴(yán)重的可達(dá)50%以上，局部田塊甚至顆粒無收，而且導(dǎo)致稻米品質(zhì)下降［1］。我國稻瘟病年發(fā)生面積400萬公頃左右，嚴(yán)重年份800萬公頃左右，每年因稻瘟病危害損失稻谷2～10億千克［2］。防治水稻稻瘟病主要有兩種途徑，其一是使用化學(xué)農(nóng)藥，其二是種植抗病品種。化學(xué)藥劑的使用會對自然環(huán)境造成污染和破壞、增加成本、增大稻谷中的農(nóng)藥殘留量等，而應(yīng)用抗病品種既對環(huán)境無污染又不傷害天敵，具有保護環(huán)境的重要意義。

20世紀(jì)60年代以來，日本、國際水稻研究所（IRRI)以及中國等相繼開展了稻瘟病的研究，并已取得了較大的進展，利用經(jīng)典的稻瘟病遺傳分析方法與分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，目前至少已經(jīng)標(biāo)記定位50個稻瘟病抗性基因［3～5］，其中來自小粒野生稻Oryzaminuta的Pi9（t)基因是－個顯性廣譜高抗稻瘟病基因，找到了與該基因緊密連鎖的分子標(biāo)記［6～7］。瀘恢17、瀘恢602是我所育成的耐熱、高配合力恢復(fù)系，已育成多個組合通過各級審定，其中Ⅱ優(yōu)7號、Ⅱ優(yōu)602被農(nóng)業(yè)部列為超級稻品種及重點推廣品種，推廣面積133萬公頃以上;瀘恢17的育成獲得2005年國家科技進步二等獎。

本研究以O(shè)ryzaminuta、瀘恢17、瀘恢602為親本，通過雜交、復(fù)交、自交，對分離世代進行分子標(biāo)記輔助選擇、人工接菌鑒定、農(nóng)藝性狀選擇及配合力鑒定，培育出抗稻瘟病、耐熱力較強、配合力較高的恢復(fù)系。

1 實驗材料與方法

1.1 試驗水稻親本

抗稻瘟病基因供體親本為Oryzaminuta，由四川省農(nóng)科院水稻高粱研究所抗病組提供。受體親本分別為瀘恢17、瀘恢602，由筆者所在的課題組育成。

1.2 分子檢測

本試驗采用CTAB法提取DNA。利用與稻瘟病抗性基因Pi-9（t)緊密連鎖分子標(biāo)記PB8，在親本間進行多態(tài)性分析，PB8引物序列為［7］：F：CCGGACTAAGTACTGGCTTCGATA; R：CCCAATCTCCAATGACCCATAAC。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)總體積為20μL，其中10×Buffer（含Mg2＋15mmol·L－1)2μL，dNTP（各2.5mmol·L－1)1μL，100μmol·L－1的引物各0.1μL，1U的rTaq酶，DNA模板1μL，加ddH2O補足20μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，58℃退火50s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳，用GoldView核酸染料染色后在紫外燈下觀察，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3 稻瘟病抗性鑒定

所用的32個稻瘟病菌株為四川近年來具有代表性的菌株，由四川省農(nóng)科院水稻高粱研究所抗病組提供，包括ZA群10個、ZB群9個、ZC群11個和ZF群2個。將具有抗性純合基因的材料和CK（CK1：瀘恢 17;CK2：瀘恢602)同時浸種、催芽后播種于塑料盤中，每個材料20～30苗，待幼苗長至三葉一心期，采用高壓噴霧的方法，用濃度為2×105mL－1的孢子懸液（含0.05%的粘附劑Tween-20)接種水稻葉片，接種后于25℃左右的溫室培養(yǎng)5～7d，其間定時用噴霧器噴水保持水稻葉片的濕度利于發(fā)病。按0～5級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查病情，0～3級為抗病，4～5級為感病，同時計算各材料的抗性頻率［10］。

1.4 抗稻瘟病材料耐熱性鑒定

將選育的新恢復(fù)系材料與綿恢725（CK)在川南高溫伏旱區(qū)（瀘州)從3月5日至4月18日分7期播種，用以調(diào)節(jié)花期。成熟時將同期齊穗的材料定點取樣10穴考查結(jié)實率。記載6～8月逐日的最高溫，數(shù)據(jù)取自距實驗地相距1km的瀘縣氣象局。應(yīng)用DPS分析系統(tǒng)［11］對各材料各播期處理結(jié)實率進行統(tǒng)計分析［8～9］。

1.5 抗稻瘟病材料配合力鑒定

將選育的新恢復(fù)系材料與Ⅱ-32A、金23A、岡46A配組，鑒定組合的產(chǎn)量水平，以綿恢527為CK，鑒定其配合力。設(shè)3次重復(fù)，每小區(qū)面積6.67m2，密度為16.6cm×20cm，常規(guī)栽培管理，成熟時每小區(qū)單獨收獲，并折合成畝產(chǎn)進行統(tǒng)計分析［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記檢測和目標(biāo)基因純合優(yōu)良株系的獲得

2005年在四川德陽開始配組，Oryzaminuta與瀘恢17雜交，收獲的F1種子同年冬季到海南加代，2006年3月在海南與瀘恢602復(fù)交，2006年8月在四川德陽復(fù)交組合自交進入F2代，2007年3月F2代苗葉瘟鑒定，抗病株MAS，淘汰不含目標(biāo)基因的單株（圖1A)。對含有目標(biāo)基因的單株（如圖1B 中2、3、5、7、8、9、11、12、14、15、17、18泳道)，在下一代株系中隨機取10～20粒種子驗證其目標(biāo)基因是否純合，若其目標(biāo)基因純合，則進行農(nóng)藝性狀選擇;若其目標(biāo)基因不純合，則繼續(xù)MAS，直至獲得目標(biāo)基因純合的株系后才進行農(nóng)藝性狀選擇。通過苗期分子標(biāo)記選擇，成株期農(nóng)藝性狀選擇，獲得一批目標(biāo)基因純合且農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的優(yōu)良株系。2008年7月，從這些株系中選擇523份單株與岡46A測配;2009年3月，海南組合鑒定，表現(xiàn)好的23份組合復(fù)測;2009年7月，四川德陽組合進一步鑒定，鑒定出優(yōu)良恢復(fù)系材料5份：R101、R102、R103、R104、R 105;2009冬，在海南以這5份恢復(fù)系材料為父本，岡46A、金23A、Ⅱ-32A為母本進行組合小制;2010年春，小制組合品比試驗。

圖1 親本多態(tài)性分析（A)及PCR檢測雜交后代分離群體（B)Fig.1 Polymorphisms of the markers between three parents（A)and assay the hybrids generations by PCR（B)

2.2 稻瘟病抗性鑒定

人工接種鑒定結(jié)果如表1所示。對照瀘恢17、瀘恢602對32個菌株中的6～9個表現(xiàn)抗病，抗性頻率分別為18.75%、28.13%;而具有Pi-9（t)的5個恢復(fù)系材料，只有4～6個菌株可以侵染，抗性頻率達(dá)81.25%～87.50%，其抗性得到極大提高。

表1 具Pi9（t)純合基因的新恢復(fù)系材料對四川32個菌株的抗性反應(yīng)Table 1 Disease reactions of the new restored lines material with Pi-9（t)to 32blast Isolate scollected in sichuan province

a)R和S分別表示抗病和感病。a)R and S stand for a resistance reaction and a susceptible reaction，respectively.

2.3 耐熱性鑒定

在花期自然高溫條件下，新育恢復(fù)材料的結(jié)實率表現(xiàn)如表2，由試驗結(jié)果可知，齊穗期從7月9日～7月28日，期間：齊穗期至齊穗后5天平均最高氣溫變幅為34.04～37.82℃，其平均結(jié)實率的變幅為68.56%～79.57%，各期間的差異極顯著，表明各齊穗期處理間的結(jié)實率差異是由高溫引起的。在自然高溫條件下，7個處理的齊穗期結(jié)實率，R101、R102、R105三份材料的結(jié)實率顯著地高于對照綿恢725，R104結(jié)實率顯著地低于對照綿恢725。說明R101、R102、R105這3份材料耐高溫能力較強。

2.4 新育恢復(fù)系材料配合力鑒定結(jié)果

各材料配合力鑒定結(jié)果如表3，由試驗結(jié)果可知，R102、R105配合力較高，其所配組合產(chǎn)量較CK略高，顯著地高于其它恢復(fù)材料所配組合的產(chǎn)量水平。

表2 新育恢復(fù)材料結(jié)實率Table 2 The seed setting rate of the new restored lines material

表3 新育恢復(fù)系材料／kg·hm－2Table 3 The force identification of the new restored lines material／kg·hm－2

綜合以上研究結(jié)果，應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，結(jié)合田間農(nóng)藝性狀選擇、抗性鑒定、耐熱性鑒定及配合力測定，我們育成了兩份抗性較強、耐熱力較強、配合力較高的三系雜交稻恢復(fù)系R102、R105。

3 討論

分子標(biāo)記輔助選擇是將分子標(biāo)記應(yīng)用于作物改良過程中進行選擇的一種輔助手段［6］。在本研究中，以攜帶Pi－9（t)基因的Oryzaminuta、瀘恢17、瀘恢602為親本，通過分子標(biāo)記輔助選擇、抗性鑒定、耐熱性鑒定及配合力測定，最終育成了兩份抗性頻率達(dá)84.38%的優(yōu)良恢復(fù)系，從而證實分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在作物育種實踐中的實用性。

通過分子標(biāo)記輔助選擇育成的2個新恢復(fù)系R102、R105，由于其具有的Pi9（t)基因為顯性抗性基因，其所配制的雜交稻組合將表現(xiàn)對稻瘟病的抗性;同時，具有較高的配合力及較強的耐熱性，具有配制出組合應(yīng)用于生產(chǎn)的潛力。此外，本研究育成的抗稻瘟病的中間材料，將是選育新的抗病恢復(fù)系的重要供體親本。

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Enhancing Rice Blast Resistance of Hybrid Rice Restorer Lines through Marker Assisted Selection of thePi-9Gene

ZENG Zheng-ming，KUANG Hao-chi，LUO Jun-tao，CHEN Guang-zhen，F(xiàn)U Jun，YANG Yang，HE Xing-cai
（RiceandSorghumResearchInstitute，SichuanAcademyofAgriculturalSciences，LuzhouBranchofNationalRice ImprovementCenter，DeyangSichuan618000，China)

Rice blast resistance genePi-9（t)has a broad spectrum of strong resistance.Oryzaminutathat has Pi-9（t)gene was used as the anti-source，and excellent recovery system LH17and LH 602for the recipient parent.Through hybridization and resumption of diplomatic relations，PB8，which tightly linked toPi9（t)was used for marker assisted selection in the separate groups.Combined with selection of the agronomic traits，five recovery materials with homoigous genes and good agronomic traits was obtained.Resistance of these five materials were identified using 32blast isolates collected in Sichuan province，the resistance frequency reached 81.25% ～87.50%.High temperature nesistance and combining alility were tested for these materials.Eventually，the recovery lines R102and R105which have strong blast and heat resistance and high combining ability were developed.

Molecular marker·assisted selection;Rice blast resistance Pi-9gene;Rice Restore

S336

A

1671-8151（2011)04-0338-05

2011-06-10

2011-07-05

曾正明（1972-)，男（漢)，四川瀘縣人，副研究員，碩士，主要從事水稻遺傳育種方面的研究。

況浩池，研究員。Tel： 13518389801;E-mail：khc1957＠163.com

四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀論文基金項目（scnk1009);四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項目（scnko911)

（編輯：武英耀)