周栩 周廣東 張路 劉豫 朱吉 曹誼林

隨著定向誘導分化技術的逐步成熟，骨髓間充質干細胞（BMSCs）逐漸成為組織工程種子細胞的最佳來源之一，目前已經被大量用于促進軟骨缺損修復的實驗研究，良好而有效的誘導方法是將BMSCs成功用于軟骨修復的關鍵[1]。地塞米松與TGF-β1、IGF-I聯(lián)合應用，可有效地促進BMSCs表達軟骨的特征性細胞外基質[2-4]。雖然以BMSCs為種子細胞在體外已經可以成功構建出組織學結構、生物化學組成與正常軟骨類似的組織工程化軟骨，但是體外不同誘導時間所構建的軟骨的組織學特性，及相互之間的關系，仍缺乏深入研究。明確經不同時間誘導的軟骨樣組織的組織學特性，對于把握組織工程組織回植體內的最佳時機至關重要。本實驗以豬的BMSCs為種子細胞，在體外分別進行成軟骨誘導1周和4周，并以未經誘導的BMSCs和軟骨細胞為對照，分析和比較不同體外誘導時間對BMSCs體外成軟骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

長楓雜交豬（n=10），1～2 月齡，6～8 Kg，雌雄不限；DMEM 培養(yǎng)液（Gibco 公司）；10%胎牛血清（Hyclone公司）；0.25%胰蛋白酶 （Sigma公司）；TGF-β1（Intergen 公司，每支 5 μg）；IGF（Intergen 公司，每支50 μg）；地塞米松（Sigma 公司，2 mg/mL）；鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體（Dako公司）；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗（Dako公司）；阿利新藍8-GX（Sigma公司）；硫酸軟骨素標準品（Sigma公司）；100 mm培養(yǎng)皿，0.22 μm針孔過濾器，50 mL離心管（Falcon公司）；編織聚羥基乙酸，聚乳酸，三氯甲烷（Sigma公司）； 倒置相差顯微鏡 （Nikon公司，Eclipse TS100）；精密電子天平 （Mettler Toledo公司）；DU-640紫外分光光度計（Beckman Coulter公司）；激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，SP5）。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)和擴增

實驗動物兩側股骨共抽取骨髓15～20 mL，分別置于兩支50 mL肝素化的無菌離心管中，加入無血清低糖DMEM培養(yǎng)液40 mL，混勻制成細胞懸液，1 500 r/min離心10 min，吸除脂肪及大部分上清液，重新振蕩混勻，以上述方法反復洗滌2次。離心后棄上清，加入10 mL含10%血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，混勻制成細胞懸液；按6×105cells/cm2細胞密度接種于培養(yǎng)皿內。置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)5～6 d，進行首次換液，3～4 d后細胞達到接近融合狀態(tài)時傳代培養(yǎng)。

1.2.2 PGA支架材料的制備

非編織聚羥基乙酸/聚乳酸（PGA/PLA）60 mg，放入注射器模具中，加入少許95%乙醇，制成直徑12 mm，厚度3 mm的圓柱體。滴加0.15%的PLA-二氯甲烷溶液0.3 mL，充分晾干后放入培養(yǎng)皿中，75%乙醇浸泡1 h，紫外線照射30 min消毒，重新置入培養(yǎng)皿中，75%乙醇浸泡3次，最后1次浸泡過夜。次日用PBS洗滌2～3次后，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液預培養(yǎng)過夜，次日吸干DMEM培養(yǎng)液后準備接種細胞。

1.2.3 細胞-材料復合物的制備

將第 2代 BMSCs按 5×107cells/cm3接種到材料上，每塊材料接種1.2 mL細胞懸液，使之均勻分布于支架材料上，轉移至培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 h后首次加培養(yǎng)液，共制作復合物10塊，隨機分組。

1.2.4 TGF－β1及 IGF-I的稀釋與保存

將TGF－β1與 IGF-I用生長因子稀釋液 （含有0.1%BSA，4 mM HCl，PBS 為溶劑）稀釋，分裝后使得每個 Eppendorf管內含 1 μg 的 TGF-β1 或 5 μg的IGF-I，生長因子分裝后保存于-20℃條件下，誘導液在換液前臨時配制。

1.2.5 實驗分組

以含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液＋0.3 g/L L-谷氨酰胺+0.05 g/L抗壞血酸+3.7g/L碳酸氫鈉+10萬U/L青霉素鉀+0.1g/L硫酸鏈霉素為培養(yǎng)液。A組以BMSCs為種子細胞：A1組用培養(yǎng)液培養(yǎng)1周（n=1）；A2 組培養(yǎng)液培養(yǎng) 4 周 （n=1）；A3 組用培養(yǎng)液＋TGF－β1 10 ng/mL＋IGF-I 50 ng/mL＋地塞米松40 ng/mL， 體外誘導1周 （n=3）；A4組用培養(yǎng)液＋TGF－β1 10 ng/mL＋IGF-I 50 ng/mL＋地塞米松 40 ng/mL，體外誘導4周（n=3）。B組以軟骨細胞為種子細胞：B1組用培養(yǎng)液培養(yǎng)1周 （n=1）；B2組用培養(yǎng)液培養(yǎng) 4 周（n=1）。

1.3 相關檢測方法

1.3.1 細胞生長情況

倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細胞在培養(yǎng)皿中的黏附和增殖。

1.3.2 細胞－材料復合物形態(tài)學觀察

倒置相差顯微鏡及掃描電鏡下連續(xù)觀察細胞貼壁、伸展及生長狀況，比較接種后細胞與材料的黏附情況，以及細胞外基質的分泌狀況。

1.3.3 組織學和免疫組化檢測

通過HE染色、Safranin O染色和Ⅱ型膠原免疫組化，對各組細胞－材料復合物的組織學特征和GAG含量進行比較。

2 結果

2.1 細胞生長情況

BMSC原代細胞呈集落樣生長，集落中央可呈復層生長，細胞為紡錘形、梭形、圓形、三角形、不規(guī)則形等，核仁1～2個。傳代后可形成單層，細胞體積增大，外形似成纖維細胞，增殖迅速，有一定的方向性，細胞接近融合后呈“旋渦”樣生長（圖1）。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察BMSCs和軟骨細胞形態(tài)（40×）Fig.1 Morphology of BMSCs and chondrocytes observed by invert phase contrast microscope （40×）

2.2 細胞－材料復合物形態(tài)學觀察

接種1周時，倒置相差顯微鏡下觀察，BMSCs在PGA/PLA材料上生長良好，迅速增殖并分泌ECM，分泌的ECM連成一體，散布于材料纖維之間，或形成膜狀覆蓋在纖維上；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞與支架材料緊密黏附，形成大量的ECM。

接種4周時，鏡下看見支架纖維間空隙被逐漸增多的細胞及ECM所填充，整個支架透光性差（圖2）。 掃描電鏡顯示，A3、A4組較 A1、A2組具有更加豐富的基質分泌，并且從1周到4周，細胞和支架逐漸由致密的膠原纖維和粘多糖構成的基質所包繞，提示我們體外一定時間的誘導，對于減輕材料回植體內后引起的炎性反應有所幫助（圖3）。

圖2 倒置相差顯微鏡下觀察細胞與材料的黏附情況（100×）Fig.2 Adhesion of cells with scaffold observed by invert phase contrast microscope(100×)

圖3 掃描電鏡觀察細胞與材料黏附性（500×）Fig.3 Adhesion of cells with scaffold observed by scanning electric microscope(500×)

2.3 組織學檢測

2.3.1 HE染色

A1、A2、A3組均未見軟骨陷窩的形成。A4組和B1、B2組可見散在的不規(guī)則的軟骨陷窩樣結構，并且可以見到散在殘留的未降解PGA纖維縱橫排列在許多陷窩之間。A4、B2組之間組織學特征較為接近，而B組軟骨陷窩比A組更肥大和明顯，核大位于陷窩中央。與B2比較，A4組軟骨陷窩主要存在于復合物的周邊部位，中心區(qū)結構較松散（圖4）。

2.3.2 Safranin O染色

A、B兩組細胞-材料復合物均產生了富含GAG的ECM。B組復合物比A組復合物具有更強烈的GAG表達，在中心區(qū)域尤為明顯，而且組織中GAG的分布明顯不同。B組復合物中均含有較高水平的GAG，而A組復合物中GAG的表達主要在組織的外周區(qū)域，而且ECM表現(xiàn)出非均一性，細胞周圍缺乏高密度的ECM（圖5）。

2.3.3 Ⅱ型膠原免疫組化

各組復合物中Ⅱ型膠原的聚集和分布與aggrecan相似。A4組復合物在組織的外周區(qū)域Ⅱ型膠原高度表達，而B組復合物具有更加均質和強烈的表達。體外GAG檢測顯示，B組和A4組均產生了含Ⅱ型膠原和aggrecan的軟骨細胞樣的ECM。但是，B組復合物比A組復合物具有更多的ECM分泌和更加均一的分布（圖6）。

圖4 各組標本HE染色（200×）Fig.4 Examination of specimens in all groups by HE staining(200×)

圖5 各組標本Safranin O染色（200×）Fig.5 Detection of Safranin O expression by immunohistochemistry staining(200×)

圖6 各組標本Ⅱ型膠原免疫組化染色（200×）Fig.6 Detection of ColⅡexpression by immunohistochemistry staining(200×)

2.4 各組細胞材料復合物中GAG含量的改變

隨著時間延長，A3、A4組和B組中GAG含量逐漸增多，其中A3組處于最低水平，B2組含量最高（圖7）。A4組中GAG含量高于A3組。方差分析顯示，A3與A4、B1與B2組之間GAG含量差異有顯著性意義（P<0.05）。

圖7 各組標本GAG含量Fig.7 GAG content test of the specimens in all groups

3 討論

如何既控制增殖又能在適當?shù)臅r候啟動BMSCs向所需方向分化有待進一步的研究。根據(jù)BMSCs構建軟骨的不同培養(yǎng)環(huán)境，分為體內構建和體外構建兩種方法。體外軟骨構建大致過程是：將體外培養(yǎng)擴增的軟骨細胞接種在可降解支架材料上，經體外長時間培養(yǎng)，生物材料逐漸降解，細胞不斷分泌軟骨特異性細胞外基質（ECM），最終在體外形成特定形狀的軟骨，再用于修復體內缺損。這種方法構建的軟骨形成和成熟過程基本上在體外完成，便于觀察和評價，而且可以分析和調控相關影響因素。更為重要的是，體外組織構建能很好地控制預塑的軟骨形態(tài)，是未來組織工程化產品大規(guī)模臨床應用的必然要求。體外構建的主要缺點是對體外培養(yǎng)環(huán)境和條件要求高。明確體外軟骨構建過程中其自身的組織學特性的變化，無疑有利于完善構建手段，并且可以合理地決定構建組織的體內回植時機。

BMSCs定向分化為軟骨細胞的必要條件是具備促分化的誘導因子。我們的結果證實了BMSCs在體外向軟骨誘導1周和4周后，能夠維持初始的大小與形狀，4周的誘導即可以有軟骨組織產生，有明顯的軟骨陷窩結構，軟骨特異性的組織化學染色呈陽性，免疫組化染色均顯示有Ⅱ型膠原的表達，說明4周的誘導時間即可以有部分細胞完成了分化的過程。體外誘導1周的BMSCs-材料復合物未見明顯的軟骨陷窩結構，軟骨特異性的組織化學染色呈陰性。但是，體外誘導4周的BMSCs-材料復合物的GAG含量不及同等數(shù)量的單純軟骨細胞-材料復合物。兩種細胞形成的復合物中，細胞外基質的結構和分布特點也不相同。這些結果提示，體外誘導時間是對BMSCs向軟骨細胞分化以及分泌軟骨細胞樣的細胞外基質有著重要影響的因素之一。

通過體外誘導1周和4周，為細胞充分黏附于支架上，并且分泌細胞外基質提供了時間。我們發(fā)現(xiàn)，雖然有些細胞從材料上流失，但大多數(shù)細胞在材料上黏附良好，分泌基質旺盛，細胞-材料復合物形態(tài)維持良好。雖然BMSC-PGA/PLA復合物經過體外成軟骨誘導4周后，分泌的軟骨細胞特異性基質要明顯優(yōu)于在體外誘導1周組，但是還差于同等時間下的軟骨細胞組，說明經過體外4周的誘導，BMSCs-PGA/PLA復合物尚未形成成熟的軟骨組織。這為我們下一步將復合物回植動物體內提供了實驗基礎。

根據(jù)本實驗結果，BMSCs在體外成軟骨誘導4周后，能夠維持初始的大小與形狀，可以形成軟骨陷窩樣組織結構，與單純軟骨細胞構建的復合物較為接近，而且GAG含量明顯高于體外誘導1周的細胞-材料復合物，達到了單純軟骨細胞構建軟骨組織的60%以上。這些結果充分說明，體外成軟骨誘導4周更有利于BMSCs向軟骨分化，作為陰性對照的A1、A2組未形成軟骨樣組織，表明單純BMSCs與PGA/PLA支架復合不能在體外非軟骨環(huán)境中自發(fā)形成軟骨組織。BMSCs-PGA/PLA的細胞材料復合物在體外經成軟骨誘導4周后形成的細胞外基質，還是沒有同期軟骨細胞形成的細胞外基質成熟，提示我們尚有其他的生物化學及機械刺激的因素[6]也對BMSCs體外構建組織工程化軟骨起著重要作用。我們相信，當闡明了體外組織工程化軟骨在不同誘導時間段的組織學特性后，隨著研究的深入和方法的進一步優(yōu)化，最終可在體外構建出具有優(yōu)良軟骨性能的、能大規(guī)模生產的組織工程化軟骨組織。

[1]Shao X,Goh JC,Hutmacher DW,et al.Repair of large articular osteochondral defects using hybrid scaffolds and bone marrowderived mesenchymal stem cells in a rabbit model[J].Tissue Eng,2006,12(6):1539-1551.

[2]Locklin RM,Oreffo RO,Triffitt JT,et al.Effects of TGF-b and bFGF on the differentiation of human bone marrow stromal fibroblasts[J].Cell Biol Int,1999,23(3):185-194.

[3]Dieudonne SC,Kerr JM,Xu T,et al.Differential display of human marrow stromal cells reveals unique mRNA expression patterns in response to dexamethasone[J].J Cell Biochem,1999,76(2):231-243.

[4]Locklin RM,Williamson MC,Beresford JN,et al.In vitro effects of growth factors and dexamethasone on rat marrow stromal cells[J].Clin Orthop,1995,313:27-35.

[5]Thomson BM,Bennett J,Dean V,et al.Preliminary characterization of porcinebone marrow stromal cells:skeletogenic potential,colonyforming activity,and response to dexamethasone,transforming growth factor beta,and basic fibroblast growth factor[J].J Bone Miner Res,1993,8(10):1173-1183.

[6]Indrawattana N,Chen G,Tadokoro M,et al.Growth factor combination for chondrogenic induction from human mesenchymal stem cell[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,320(3):914-919.