溫省初，王一飛，李?lèi)?ài)明，李冠軍，成志勇，王亞麗，石 林

斑蝥酸鈉維生素B6注射液對(duì)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖抑制及核因子κB和Caspase3/7的影響

溫省初，王一飛，李?lèi)?ài)明，李冠軍，成志勇，王亞麗，石 林

目的 探討斑蝥酸鈉 (SC)維生素B6注射液對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡及核因子κB(NF－κB)、凋亡分子Caspase3/7的影響。方法 用不同濃度 (0、1.0、2.5、5.0 mg/L)的SC維生素B6注射液處理A549細(xì)胞，觀(guān)察光鏡及Hoechst33342熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài);用噻唑藍(lán) (MTT)比色法檢測(cè)SC維生素B6注射液對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用;羅丹明123檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位;Caspase3/7活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase3/7活性;蛋白印跡檢測(cè)NF－κB P65、I－κB蛋白表達(dá)。結(jié)果 SC維生素B6注射液對(duì)A549細(xì)胞的體外增殖有明顯抑制作用，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯凋亡改變，5.0 mg/L組作用A549細(xì)胞72 h后，細(xì)胞增殖抑制率最大達(dá)到67.37%。細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著SC維生素B6注射液濃度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)，線(xiàn)粒體膜電位逐漸減弱，同時(shí)Caspase3/7蛋白活性增強(qiáng);SC維生素B6注射液作用A549細(xì)胞后NF－κB P65蛋白表達(dá)水平顯著降低 (P＜0.05)，而I－κB蛋白表達(dá)水平則無(wú)顯著變化。結(jié)論 SC維生素B6注射液可能通過(guò)抑制NF－κB P65表達(dá)，激活Caspase－3/7活性，從而抑制A549細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

癌，非小細(xì)胞肺;斑蝥酸鈉維生素B6;A549細(xì)胞系;膜電位，線(xiàn)粒體;Caspase3/7;NF－κB

肺癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命和健康的主要惡性腫瘤之一，我國(guó)肺癌死亡率是所有腫瘤中上升最快的，成為我國(guó)居民的主要死因。肺癌的總體治療效果差，5年生存率僅為5%～10%，近30年來(lái)無(wú)明顯改善。大劑量高頻率的化療常導(dǎo)致患者不能耐受及出現(xiàn)各種不良化療毒副作用［1］。

斑蝥素 (cantharidin，CTD)來(lái)源于傳統(tǒng)中藥斑蝥，臨床多用于治療中晚期惡性腫瘤［2－8］。斑蝥酸鈉 (SC)為斑蝥酸衍生物，與CTD相比，其毒性低，能夠明顯改善晚期腫瘤患者的生存質(zhì)量，是一種廣譜抗腫瘤中藥，同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞 (NK細(xì)胞)及浸潤(rùn)腫瘤淋巴細(xì)胞(TIL)的活性，并可刺激機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生白介素，增強(qiáng)抗腫瘤效果［7－8］。臨床研究顯示，SC單藥或聯(lián)合化療對(duì)肝癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤均有明顯療效，并能夠改善患者放化療等不良反應(yīng)，減輕化療對(duì)白細(xì)胞的抑制作用［8］。SC維生素B6注射液是由SC和維生素B6配制的注射液，臨床上應(yīng)用于多種腫瘤的治療，但其分子作用機(jī)制尚不清楚［8］。本研究通過(guò)觀(guān)察不同劑量的SC維生素B6對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，探討SC維生素B6抑制肺癌細(xì)胞的可能的分子作用機(jī)制，為臨床肺癌的綜合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SC維生素B6注射液 (艾易舒，貴州柏強(qiáng)制藥有限公司生產(chǎn))。噻唑藍(lán) (MTT)、碘化丙啶 (PI)、RNA酶、二甲基亞砜 (DMSO)及羅丹明123(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn));SYBR Green Real Master Mix［天根生化科技 (北京)有限公司］;Caspase－Glo 3/7 Assay試劑盒 (Promeg，USA);人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液病研究所)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM 1640培養(yǎng)液中，37℃、5%二氧化碳 (CO2)、飽和濕度條件下培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察 收集終濃度為0、2.5 mg/L的SC維生素B6處理48 h的A549細(xì)胞，1×磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌2次，細(xì)胞離心，涂片后Wright染色，光鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.3 Hoechst33342檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集終濃度為0、5.0 mg/L的SC維生素B6處理48 h的A549細(xì)胞，1×PBS洗滌2次，加入熒光染料Hoechst33342至終濃度10.0 mg/L。常溫避光染色15 min，取40 μl細(xì)胞懸液，在激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm熒光顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果并計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞所占比例。

1.2.4 體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 取指數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，制成1×105/L單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔200 μl，棄上清 (培養(yǎng)液)，根據(jù)SC維生素B6的濃度分為0 mg/L組、1.0 mg/L組、2.5 mg/L組、5.0 mg/L組，每組3孔，在細(xì)胞孵育12、24、48、72 h后每孔分別加入5 g/L濃度的MTT 20 μl，孵育4 h，棄上清，加200 μl的DMSO，置于微量振蕩器振蕩5 min混勻，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)波長(zhǎng)490 nm的吸光度值 (A值)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。細(xì)胞增殖抑制率=［(對(duì)照組A值－空白組A值) － (給藥組A值－空白組A值)］ /(對(duì)照組A值－空白組A值) ×100%。其中對(duì)照組為0 mg/L SC維生素B6干預(yù)組，空白組指單純加入DMSO所檢測(cè)值，給藥組為不同濃度SC維生素B6干預(yù)組。

1.2.5 羅丹明123檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位 (ΔΨm)變化 分別收集不同濃度SC維生素B6處理后的A549細(xì)胞，每組細(xì)胞為1×106個(gè)。1×PBS洗滌2次后重懸于5 mg/L的羅丹明123(由線(xiàn)粒體攝取的陽(yáng)離子親脂染料，細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的攝取量與線(xiàn)粒體跨膜電位ΔΨm呈正相關(guān))，在37℃、5%CO2條件下孵育30 min，用1×PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

1.2.6 Caspase3/7活性檢測(cè) 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A(yíng)549細(xì)胞5 000個(gè)，共100 μl，加于96孔板中，每組3孔，加入終濃度為5 mg/L的SC維生素B6分別培養(yǎng)12 h，將Caspase－Glo 3/7底物和PBS混合，取100 μl加入上述標(biāo)本中，混合孵育1 h后酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)波長(zhǎng)405 nm處的A值，未加任何試劑的空白孔作參照，計(jì)算不同濃度SC維生素B6干預(yù)組與對(duì)照組A值的比值，確定活化程度。

1.2.7 蛋白印跡 (Western blotting) 收集不同濃度SC維生素B6處理后的A549細(xì)胞，每組107細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞核蛋白及胞質(zhì)蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞核蛋白及胞質(zhì)蛋白，用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，分裝后置－20℃保存。取80 μg樣品蛋白質(zhì)加入等體積PBS，經(jīng)5%濃縮膠和10%SDS－PAGE凝膠電泳后，用水浴式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。經(jīng)5%BSA 37℃封閉1 h，分別加入小鼠抗人核因子κB(NF－κB)P65及I－κB單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。用TBS漂洗5 min×3次，加入山羊抗小鼠HRP標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h，再次TBS漂洗5 min×3次?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)后分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以(±s)表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn);多組均數(shù)間比較用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 對(duì)照組及5 mg/L的SC維生素B6處理48 h的A549細(xì)胞，Wright染色，光鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化。對(duì)照組A549細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭形或多角形，細(xì)胞質(zhì)飽滿(mǎn)，細(xì)胞核呈圓形或橢圓，體積大，染色質(zhì)疏松 (見(jiàn)圖1A);5 mg/L的SC維生素B6干預(yù)組細(xì)胞大部分脫落，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡樣變，染色質(zhì)高度濃縮邊集，核碎裂、溶解(見(jiàn)圖1B)。

圖1 對(duì)照組及SC維生素B6干預(yù)組細(xì)胞A549形態(tài)學(xué)變化 (Wright染色，×400)Figure 1 The morphologic change of A549 cells treated with or without sodium cantharidate vitamin B6

2.2 Hoechst33342熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Hoechst33342檢測(cè)凋亡，正常細(xì)胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈梭形、卵圓形，淡藍(lán)色 (見(jiàn)圖2A);而凋亡細(xì)胞的核由于濃集而呈亮藍(lán)色或核呈分葉，碎片狀，邊集 (見(jiàn)圖2B)。結(jié)果顯示5 mg/L的SC維生素B6處理48 h后的A549細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比例 (55.6±5.3)%與對(duì)照組 (3.3±1.9)%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=17.6，P＜0.01)。

圖2 Hoechst33342熒光染色檢測(cè)SC維生素B6處理后A549細(xì)胞凋亡(×400)Figure 2 Detecting apoptosis after treated with sodium cantharidate vitamin B6with Hoechst33342 fluorescent staining

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用MTT比色法，對(duì)SC維生素B60、1.0、2.5、5.0 mg/L干預(yù)組處理A549細(xì)胞后0、12、24、48、72 h的細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示:細(xì)胞增殖抑制率呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性增加，5.0 mg/L組作用A549細(xì)胞72 h后，細(xì)胞增殖抑制率最大達(dá)到 (67.37±6.22)%，顯著高于0 mg/L組 (t=20.21，P＜0.01，見(jiàn)圖3)。

圖3 不同濃度SC維生素B6作用于A(yíng)549細(xì)胞不同時(shí)間后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線(xiàn)圖Figure 3 A549 cells growth inhibiting curve after treated with different concentration of sodium cantharidate vitamin B6

2.4 不同濃度SC維生素B6對(duì)A549細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的影響 不同濃度SC維生素B6處理A549細(xì)胞12、24 h后，0 mg/L干預(yù)組A549細(xì)胞內(nèi)羅丹明123熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，隨著SC維生素B6濃度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)羅丹明123熒光強(qiáng)度逐漸減弱，呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性減低 (見(jiàn)表1)。

2.5 Caspase－3/7蛋白活性及檢測(cè) SC維生素 B60、1、2.5、5.0 mg/L處理A549細(xì)胞12 h后，caspase－3/7活性分別為 (0.218±0.021)、(0.255±0.021)、(0.293±0.021)、(0.395±0.032)，不同濃度SC維生素B6干預(yù)組caspase－3/7活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=29.73，P=0.00);且1.0、2.5、5.0 mg/L干預(yù)組caspase－3/7活性均顯著高于0 mg/L干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)?？梢?jiàn)Caspase－3/7蛋白活性呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性升高。

2.6 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因NF－κB P65及I－κB蛋白檢測(cè) 應(yīng)用Western blot檢測(cè)2.5 mg/L SC維生素B6處理A549細(xì)胞24、48 h后NF－κB P65及I－κB蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示:2.5 mg/L SC維生素B6處理A549細(xì)胞24、48 h后，NF－κB P65表達(dá)水平顯著降低，并呈時(shí)間依賴(lài)性，而I－κB蛋白表達(dá)水平則無(wú)顯著變化 (見(jiàn)圖4)。

表1 不同濃度SC維生素B6處理12、24 h后A549細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的變化 (n=3)Table 1 The change of mitochondrial membrane potential after treated with different concentration of sodium cantharidate vitamin B6in 12 or 24 hours

圖4 2.5 mg/L SC維生素B6處理A549細(xì)胞不同時(shí)間后NF－κB P65及I－κB蛋白表達(dá)水平變化Figure 4 The protein levels of NF－κB P65 and I－κB protein after A549 cells treated with 2.5 mg/L sodium cantharidate vitamin B6in different time

3 討論

肺癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一，手術(shù)、放療及化療目前仍是肺癌治療的首選措施和最有效的方法。肺癌早期缺乏特異的癥狀，大多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期，同時(shí)出現(xiàn)胸腔積液及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。通常只有10%～30%的患者能接受根治性切除手術(shù)，導(dǎo)致肺癌患者的整體預(yù)后差［1］。目前認(rèn)為，只有通過(guò)綜合性治療才能真正延長(zhǎng)肺癌患者生存期。中醫(yī)藥在肺癌的治療中發(fā)揮著重要作用，中西醫(yī)結(jié)合治療已成為肺癌治療的一種重要手段［2］。CTD為我國(guó)傳統(tǒng)中藥斑蝥的活性成分，并對(duì)多種腫瘤有一定的治療效果，同時(shí)具有升高白細(xì)胞而無(wú)骨髓抑制等優(yōu)點(diǎn)［3－9］。多種腫瘤組織中存在 NF－κB及 FAK活性，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲性增加并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［10－11］。有研究顯示CTD能夠抑制NF－κB及黏著斑激酶 (FAK)磷酸化而抑制腫瘤的增殖及血管新生［6］。SC系CTD的半合成藥物，具有提高機(jī)體免疫力、升高白細(xì)胞等療效，多用于中晚期惡性腫瘤的治療［7－9］。SC維生素B6注射液是SC和維生素B6的螯合物，其誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示，SC維生素B6作用對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。5.0 mg/L的SC維生素B6處理48 h后，A549細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡形態(tài)改變;72 h后，細(xì)胞增殖抑制率最大達(dá)到67.37%。

線(xiàn)粒體膜電位是由線(xiàn)粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子及其他離子不平衡而形成的，是保持線(xiàn)粒體功能所必需的。在線(xiàn)粒體內(nèi)、外膜交界處存在一種蛋白性孔道，即膜滲透性轉(zhuǎn)換通道 (PTP)，其受到損傷刺激后開(kāi)放，引起線(xiàn)粒體膜電位的下降，釋放細(xì)胞色素C等，最終激活Caspase－3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12－14］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的SC維生素B6處理12、24 h后，A549細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位水平明顯降低，呈現(xiàn)時(shí)間劑量依賴(lài)性。研究表明Caspase－3/7為凋亡執(zhí)行分子，激活后表明細(xì)胞進(jìn)入凋亡的最后階段。Caspase－3以酶原的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在凋亡的早期階段被激活，活化的Caspase－3由兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基組成，裂解相應(yīng)的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13－16］。本研究結(jié)果顯示:SC維生素 B6抑制A549細(xì)胞后，細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序，Caspase－3/7蛋白活性在12 h內(nèi)明顯增加，并呈現(xiàn)時(shí)間、劑量依賴(lài)性。

NF－κB廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，是將信息從細(xì)胞質(zhì)傳至細(xì)胞核引起相應(yīng)基因表達(dá)的重要的轉(zhuǎn)錄因子。NF－κB的異常激活可誘導(dǎo)促癌基因c－myc的激活，使其過(guò)量表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞的增殖。NF－κB也能直接抑制重要的凋亡相關(guān)分子Caspase－8的活化，從而抑制Caspase－3等一系列下游Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。研究表明，NF－κB在多種抗癌藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起作用，腫瘤細(xì)胞NF－κB的活化是其對(duì)抗癌藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抗性的機(jī)制［15－17］。本研究顯示:肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞高表達(dá)NF－κB，2.5 mg/L SC維生素B6處理A549細(xì)胞24、48 h后，NF－κB蛋白表達(dá)水平逐漸減低，而I－κB表達(dá)水平無(wú)顯著變化，同時(shí)Caspase－3/7活性增加，故推測(cè)SC維生素B6通過(guò)抑制NF－κB表達(dá)而增強(qiáng)了Caspase－3/7的活性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，SC維生素B6具有高效促肺癌A549細(xì)胞凋亡及抑制增殖作用，是一種有效的肺癌治療藥物，對(duì)于其臨床效果的觀(guān)察及其作用機(jī)制的研究將是今后工作的重點(diǎn)。

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Effects of Sodium Cantharidate Vitamin B6on Proliferation，Apoptosis and Influence of NF－κB and Caspase3/7 on Hu-man Lung Cancer A549 Cells

WEN Xing －chu，WANG Yi－fei，LI Ai－ming，et al.Department of Surgical Oncology，the First Hospital of Baoding，Baoding 071000，China

ObjectiveTo investigate the effect of sodium cantharidinate(SC)vitamin B6on human non－small cell lung cancer A549 cell proliferation，apoptosis and the influence of transcription factor NF － κB and apoptosis molecules Caspase3/7.MethodsDifferent concentrations of SC vitamin B6and A549 cells were cultured together;Cells apoptosis was tested by light microscopy and fluorescent staining Hoechst33342 morphology;MTT assay tested cell proliferation;Rhodamine 123 examined mitochondrial membrane potential;Caspase3/7 activity assay kit tested Caspase3/7 activity;Western blot detected of NF－κB P65，I－κB protein levels.ResultsSC vitamin B6inhibited the A549 cells proliferation，of which there were apparent apoptotic morphological changes.When 5.0 mg/L group roled in A549 cells 72 h，cell proliferation inhibition rate reached 67.37 percent maximum.Mitochondrial membrane potential results showed that with increasing concentration of SC vitamin B6and time，the mitochondrial membrane potential gradually weakened，while Caspase3/7 protein activity increased.After SC vitamin B6was added in A549 cells，NF－κB P65 protein levels was reduced(P ＜0.05)and I－κB protein levels had no changes.ConclusionSC vitamin B6inhibits the NF－κB P65 expression，activates caspase－3/7 activities which inhibits A549 cells proliferation and induce apoptosis.

Carcinoma，non－small－cell lung;Sodium cantharidinate vitamin B6;A549 cell line;Membrane potential，mitochondria;Caspase3/7;NF －kappa B

R 734.2

A

1007－9572(2011)12－4176－04

071000河北省保定市第一醫(yī)院腫瘤外科 (溫省初，王一飛，李?lèi)?ài)明，李冠軍)，血液內(nèi)科 (成志勇，王亞麗);保定市第二醫(yī)院外科 (石林)

2011－05－10;

2011－10－23)

(本文編輯:劉莉)