王振寶，呂品田，賈漪濤，王志敏，黃萬(wàn)剛，耿瑞超，李中信

磷脂酰肌醇－3－羥基激酶抑制劑LY294002對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子促人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620增殖和遷移行為的影響

王振寶，呂品田，賈漪濤，王志敏，黃萬(wàn)剛，耿瑞超，李中信

目的 探討磷脂酰肌醇－3－羥基激酶 (PI3K)抑制劑LYZ94002在肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (HGF)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620增殖、侵襲中所起的作用。方法 分別用噻唑藍(lán)比色法 (MTT)、流式細(xì)胞術(shù)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡及移行情況。結(jié)果 (1)MTT法結(jié)果顯示，LY294002≥20 μmol/L實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組吸光度(OD)值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。(2)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，LY294002≥20 μmol/L實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組凋亡率及增殖指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。(3)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LY294002≥40 μmol/L實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組移行距離比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。結(jié)論 PI3K信號(hào)通路抑制劑能夠阻斷HGF對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、移行的促進(jìn)作用。

PI3K/AKT;肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子;結(jié)腸腫瘤;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡;移行

結(jié)直腸癌是我國(guó)胃腸道最常見的惡性腫瘤之一，隨著生活環(huán)境和飲食習(xí)慣及結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。盡管目前采用了包括手術(shù)、化療和放療在內(nèi)的綜合治療，但總體效果仍不令人滿意，其總的5年生存率仍徘徊在60%～70%［1］。治療失敗的主要原因在于腫瘤發(fā)生了復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。然而，惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制遠(yuǎn)未闡明。

在已知的多個(gè)參與腫瘤轉(zhuǎn)移基因當(dāng)中，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)備受關(guān)注。HGF是一種多功能的生物學(xué)因子，具有強(qiáng)促分裂、組織成形、誘導(dǎo)上皮細(xì)胞遷移、侵襲以及誘導(dǎo)血管生成等作用［2］，可由多種細(xì)胞分泌。HGF的受體是c－Met癌基因編碼的c－Met蛋白。正常的HGF/c－Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在胚胎發(fā)育、組織損傷修復(fù)中起重要作用，而異常的HGF/c－Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與腫瘤發(fā)生，尤其是侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3］。有資料顯示，結(jié)直腸癌患者血漿中的HGF水平增高，且分期越晚，HGF的表達(dá)水平越高，合并肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者較無(wú)肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的HGF表達(dá)水平更高［2－4］。磷脂酰肌醇 －3 － 羥基激酶/蛋白激酶 B(PI3K/AKT)是HGF下游信號(hào)通路中的一條，參與了許多生物功能的調(diào)節(jié)如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞周期等，但同時(shí)有研究顯示腫瘤的生成與發(fā)展也與PI3K/AKT途徑有關(guān)［5］。

我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，HGF可以促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的增殖、移行，并使細(xì)胞內(nèi)微絲、微管數(shù)量增加［6］。但尚不清楚阻斷PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路是否會(huì)抑制HGF的促SW620增殖及侵襲作用。

本實(shí)驗(yàn)在人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620中加入PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002后加入人重組肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (rhHGF)，應(yīng)用噻唑藍(lán)比色法 (MTT)、劃痕實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)，觀察用LY294002阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)HGF的促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620增殖、移行作用的影響，以期闡明PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)HGF/c－Met促進(jìn)腫瘤增殖、移行的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SW620人結(jié)腸癌細(xì)胞系由浙江大學(xué)鄭樹教授惠贈(zèng)，rhHGF購(gòu)自PEPROTECH公司 (美國(guó))，U0126購(gòu)自 Invitrogen/GIBCO公司 (美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的培養(yǎng) SW620細(xì)胞株用沙氏瓊脂培養(yǎng)基 (RPMI－1640)置于37℃、5%二氧化碳 (CO2)的條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2～3 d用胰酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法分析LY294002對(duì)SW620增殖的影響 將SW620細(xì)胞以1.0×104/ml濃度接種于96孔培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)組分6組，前5組加入終濃度為80、40、20、10、5 μmol/L的LY294002，第6組加終濃度為0.1%體積濃度的二甲基亞砜(DMSO)為DMSO組，對(duì)照組加入同體積的培養(yǎng)液。30 min后各組均加入終濃度為20 μg/L的HGF，培養(yǎng)48 h后測(cè)定各孔的吸光度 (OD)值。抑制率為: (OD對(duì)照組－OD實(shí)驗(yàn)組)/OD對(duì)照組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LY294002對(duì)SW620細(xì)胞周期、凋亡的影響 將SW620細(xì)胞以1.0×106/ml濃度接種于培養(yǎng)瓶，實(shí)驗(yàn)組4組分別加入終濃度為 80、40、20、10 μmol/L的LY294002，對(duì)照組加入同體積的培養(yǎng)基，30 min后5組分別加入終濃度為20 μg/L HGF，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞、漂洗離心、固定、送流式細(xì)胞儀檢測(cè)，增殖指數(shù) (PI)=合成期(S)、分裂前期 (G)、分裂期 (M)細(xì)胞總數(shù)占不同細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)的百分比，即 (S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LY294002對(duì)SW620移行的影響 將SW620細(xì)胞以2.0×106/孔接種于六孔培養(yǎng)板中，8 h后用10 μl槍頭在6孔培養(yǎng)板上劃痕，實(shí)驗(yàn)組分為3組，前2組加入終濃度為80、40 μmol/L的LY294002，第3組為 DMSO組加入終濃度為0.1%體積濃度的DMSO，對(duì)照組加同體積的培養(yǎng)液。30 min后各組加入終濃度為20 μg/L的HGF，24 h后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并更換培養(yǎng)基并加入相應(yīng)濃度的LY294002、HGF，繼續(xù)培養(yǎng)。每24 h重復(fù)上述步驟，直至第3 d。采用Image pro plus軟件測(cè)量劃痕空白區(qū)寬度，并計(jì)算出其移行距離 L(μm)，公式為:L(μm)=(L 0 h－L n h)/2。移行距離抑制率為:(L對(duì)照組－L實(shí)驗(yàn)組)/L對(duì)照組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用(±s)表示，組間比較采用單因素多水平方差分析 (one way ANOVA)，多重比較用SNK－q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LY294002對(duì)SW620增殖的影響 應(yīng)用MTT法結(jié)果顯示，不同濃度實(shí)驗(yàn)組、DMSO組、對(duì)照組OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。其中終濃度為 80、40、20 μmol/L LY294002實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);且這3個(gè)濃度組間OD值比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。3個(gè)濃度組對(duì)SW620增殖的抑制率分別為35.1%、29.9%、14.2%。

2.2 LY294002對(duì)凋亡、細(xì)胞分裂周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)顯示，不同濃度實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中終濃度為80、40、20 μmol/L LY294002實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);且這3個(gè)濃度組間凋亡率比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組PI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。其中終濃度為80、40、20 μmol/L LY294002實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組PI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);且這3個(gè)濃度組間PI比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表2)。

表1 LY294002不同濃度對(duì)SW620細(xì)胞增殖的影響Table 1 The effect of LY294002 of different concentrations on the proliferation of SW620 cells

表2 LY294002對(duì)SW620細(xì)胞凋亡率及PI的影響(±s)Table 2 The effect of LY294002 on the apoptosis ratio and PI of SW620cells

表2 LY294002對(duì)SW620細(xì)胞凋亡率及PI的影響(±s)Table 2 The effect of LY294002 on the apoptosis ratio and PI of SW620cells

注:與對(duì)照組比較，▲P＜0.05;與對(duì)照組比較，△P＞0.05;與20 μmol/L組比較，*P ＜0.05;與40 μmol/L組比較，■P ＜0.05

組別 次數(shù) 凋亡率PI實(shí)驗(yàn)組(μmol/L)80 3 1.45±0.06▲＊■ 35.1±2.2▲＊■40 3 1.20±0.08▲＊ 44.8±1.4▲＊20 3 1.04±0.12▲ 48.6±2.2▲10 3 0.74±0.14△ 52.5±1.1△對(duì)照組 3 0.61±0.08 55.2±2.8 F 58.92 72.99 P值值＜0.05 ＜0.05

2.3 LY294002對(duì)SW620移行的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，藥物作用24 h、48 h、72 h后實(shí)驗(yàn)組、DMSO組與對(duì)照組移行距離比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。其中24 h后，80 μmol/L LY294002實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組移行距離比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);48 h、72 h后80、40 μmol/L LY294002實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組移行距離比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);而24 h、48 h、72 h后DMSO組與對(duì)照組移行距離比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。80 μmol/L LY294002實(shí)驗(yàn)組24 h、48 h、72 h的移行距離抑制率分別為61.2%、61.7%、54.3%(見表3)。

表3 LY294002不同時(shí)間對(duì)SW620細(xì)胞移行距離及其抑制率的影響Table 3 The effect of LY294002 on the migration ratio of SW620 cells

3 討論

HGF是一種廣泛分布于各組織的細(xì)胞外信號(hào)因子，不僅存在于多種正常組織細(xì)胞內(nèi)，而且一些腫瘤細(xì)胞也可以產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者的血漿中HGF水平明顯高于正常人［5］。我們的前期實(shí)驗(yàn)表明，HGF可以促進(jìn)SW620細(xì)胞的增殖、移行及上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial cell growth factor A，VEGF－A)、VEGF－C、VEGF－D 的表達(dá)［6］。另有研究顯示，PI3K/AKT通路在細(xì)胞中普遍表達(dá)信號(hào)途經(jīng)，不僅參與正常細(xì)胞的生理活動(dòng)，還與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物行為有關(guān)［7］。在未轉(zhuǎn)化的腸上皮細(xì)胞和結(jié)腸腫瘤細(xì)胞中，PI3K/AKT信號(hào)通路已經(jīng)證實(shí)能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)來自生長(zhǎng)因子受體的促有絲分裂信號(hào)［8］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002抑制了HGF促SW620細(xì)胞增殖、移行及抗凋亡的作用。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度的LY294002抑制HGF對(duì)SW620細(xì)胞增殖的抑制率是不同的，即濃度較高的LY294002抑制HGF對(duì)SW620細(xì)胞增殖作用大，提示LY294002抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活性可以抑制HGF促進(jìn)SW620增殖的生物學(xué)活性，而被激活的PI3K是靠進(jìn)一步激活其下游AKT來發(fā)揮作用的。Nanaw等［9］發(fā)現(xiàn)人類結(jié)腸直腸腫瘤組織中磷酸化AKT表達(dá)增多，活化的AKT通過促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制其凋亡從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度的LY294002對(duì)SW620細(xì)胞凋亡率是不同的，濃度較高的對(duì)SW620細(xì)胞的凋亡率較高，LY294002有效地抑制了HGF促進(jìn)SW620細(xì)胞周期進(jìn)程，起到抗凋亡作用，提示LY294002可能是通過抑制PI3K進(jìn)而抑制了其下游細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)而導(dǎo)致了SW620細(xì)胞增殖減少、凋亡率增加。這與文獻(xiàn)報(bào)道的一致［10］。這些研究都為抑制PI3K即能抑制HGF促進(jìn)SW620細(xì)胞周期進(jìn)程、抗凋亡的生物學(xué)活性提供了有力的證據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，高濃度的LY294002可以抑制20 μg/L HGF對(duì)SW620促移行作用。本實(shí)驗(yàn)加入PI3K抑制劑后出現(xiàn)移行距離縮短，證明抑制PI3K信號(hào)通路可以抑制HGF對(duì)SW620細(xì)胞促移行作用。研究顯示，作為PI3K下游信號(hào)的AKT可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白中間絲重構(gòu)從而提高細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力［11］。

HGF通過激活c－Met受體使其發(fā)生自體磷酸化，被激活的c－Met受體與細(xì)胞內(nèi)的一些靶蛋白直接作用導(dǎo)致包括PI3K/PKB、ERK/MAPK、磷脂酶、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白及其相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄激活子STAT等信號(hào)傳遞途徑的級(jí)聯(lián)激活。由此可見HGF是靠多條信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)作用的，抑制其中某一條通路是否會(huì)出現(xiàn)抑制腫瘤的作用，不僅與該信號(hào)通路是否管理著細(xì)胞的存活生長(zhǎng)機(jī)制;在該機(jī)制中所起作用的多少;是否會(huì)產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié);還與阻斷該信號(hào)途經(jīng)其他信號(hào)途經(jīng)是否會(huì)代償性增強(qiáng)等有關(guān)。不同基因在不同種類的細(xì)胞中表達(dá)量是不同的，即使是同一種腫瘤中，不同個(gè)體腫瘤內(nèi)某一關(guān)鍵蛋白表達(dá)量也是有所差別的，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的產(chǎn)生也與HGF及其受體c－Met和PI3K在該細(xì)胞中表達(dá)的相對(duì)水平有關(guān)，而且對(duì)于抑制該信號(hào)途經(jīng)關(guān)鍵分子PI3K后其下游信號(hào)即AKT的量是否下降也需進(jìn)一步檢測(cè)。

總之，PI3K抑制劑LY294002能夠抑制HGF促進(jìn)腫瘤細(xì)胞SW620的增殖、移行及抗凋亡作用，這為探索新的治療結(jié)直腸癌方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 馬順茂，賈漪濤，劉紅磊，等.基質(zhì)金屬蛋白酶7及基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究 ［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2011，14(4):1324.

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The Role of PI3K Inhibitors(LY294002)in the Proliferation，Apoptosis and Migration of SW620 Activated by HGF

WANG Zhen－bao，LV Pin－tian，JIA Yi－tao，et al.The Second Department of Surgery，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China

ObjectiveTo investigate the role of PI3K inhibitors(LY294002)in the proliferation，apoptosis and migration of SW620 activated by HGF.MethodsThe proliferation of SW620 cells activated by HGF was assessed by MTT，while the apoptosis was examined by Flow Cytometry(FCM)and the migration was detected by Scratch test.Results(1)MTT test showed that LY294002≥20 μmol/L，and the difference of OD value between experiment group and control group was statistically significant(P ＜0.05).(2)Flow cytometry showed that LY294002≥20 μmol/L.The differences of apoptosis rate and proliferation index between experiment group and control group were statistically significant(P＜0.05).(3)Scratch test showed that LY294002≥40 μmol/L.The difference of migration of SW620 between experiment group and control group was statistically significant(P＜0.05).ConclusionPI3K/AKT signaling pathway can inhibit the activation of proliferation，apoptosis and migration of SW620 by HGF.

PI3K/AKT;Hepatocyte growth factor;Colonic neoptasms;Cell proliferation;Apoptosis;Migration

R 735.3

A

1007－9572(2011)12－4170－03

國(guó)家自然科學(xué)基金 (81172332)

050051河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外二科 (王振寶，黃萬(wàn)剛，耿瑞超，李中信);河北省人民醫(yī)院腫瘤二科(呂品田);河北省人民醫(yī)院腫瘤三科 (賈漪濤);河北省邢臺(tái)市腫瘤醫(yī)院腹瘤科 (王志敏)

李中信，050051河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外二科;E－mail:lizhongxin99@yahoo.com.cn

2011－09－15;

2011－11－15)

(本文編輯:丁云)