李成祥 孫才新 姚陳果 米 彥 周 瑋 熊正愛

1(重慶大學(xué)輸配電裝備及系統(tǒng)安全與新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400030)

2(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶 400061)

引言

美國學(xué)者James C.Weaver等研究發(fā)現(xiàn)，在一定劑量(場強(qiáng)為 kV/cm級、脈寬為 μs級)的脈沖電場作用下，當(dāng)細(xì)胞膜兩側(cè)所承受的跨膜電壓超過其絕緣強(qiáng)度時，膜上將出現(xiàn)的一些被稱為“微孔”的暫時性親水性通道［1－2］。此時，細(xì)胞膜的滲透性將大大增強(qiáng)，電導(dǎo)率亦隨之激增。脈沖電場取消后，大多數(shù)情況下微孔會關(guān)閉而不會對細(xì)胞造成任何影響，這種細(xì)胞膜出現(xiàn)暫時微孔的物理過程稱為可逆電穿孔(reversible electroporation，RE)。若脈沖電場劑量較大，細(xì)胞膜會出現(xiàn)不可恢復(fù)的破裂而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這就是不可逆電穿孔 (irreversible electroporation，IRE)［3－5］。目前，RE 已廣泛用于生物技術(shù)、基因工程和臨床醫(yī)學(xué)等許多領(lǐng)域［5－7］，而IRE則以其獨(dú)特的優(yōu)勢和療效開始應(yīng)用于腫瘤的臨床治療［8－9］。

與應(yīng)用研究相比，微秒脈沖電場電穿孔效應(yīng)的機(jī)理研究相對滯后。現(xiàn)有的機(jī)理研究大多圍繞細(xì)胞外膜(細(xì)胞膜)和內(nèi)膜(細(xì)胞器膜)的跨膜電壓而展開。Tadej建立了球形單細(xì)胞三層介電模型［10－11］，推導(dǎo)了不同波形脈沖電場作用下細(xì)胞外膜跨膜電壓的計(jì)算公式。Schoenbach等在Tadej模型基礎(chǔ)上，建立了脈沖電場與細(xì)胞相耦合的球形單細(xì)胞電路模型，解釋了高強(qiáng)度窄脈沖電場作用于胞內(nèi)細(xì)胞器并產(chǎn)生胞內(nèi)電處理效應(yīng)的機(jī)理［12］。Yao等建立了考慮細(xì)胞核并適用于全頻段分析的球形單細(xì)胞五層電場模型，研究了細(xì)胞內(nèi)外膜跨膜電壓的頻率響應(yīng)特性，提出了全頻段脈沖電場的窗口效應(yīng)理論［13－14］。Yao等認(rèn)為微秒脈沖電場含有較多的低頻分量，其主要作用靶點(diǎn)為細(xì)胞外膜，難以透入細(xì)胞而對胞內(nèi)的線粒體及細(xì)胞核等細(xì)胞器產(chǎn)生影響;只有當(dāng)脈沖寬度減少至納秒甚至皮秒級時，脈沖電場的靶點(diǎn)才會跨過細(xì)胞外膜而作用于胞內(nèi)細(xì)胞器并最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡［13－16］。

然而，上述研究均忽略了電穿孔過程中細(xì)胞各組成部分電參數(shù)的變化，即假設(shè)包括膜電導(dǎo)率在內(nèi)的電參數(shù)在外加脈沖電場作用過程中保持恒定，并以此為基礎(chǔ)展開研究。事實(shí)上，電穿孔過程中，由于微孔的出現(xiàn)，細(xì)胞膜的通透能力大大增強(qiáng)，其屏障功能減弱或失去，電導(dǎo)率隨之激增，此外，隨著孔洞尺寸的增大和數(shù)量的增多，電導(dǎo)率亦會不斷增大［17］。而細(xì)胞膜的電導(dǎo)率一旦發(fā)生改變，必然會導(dǎo)致脈沖電場誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)外膜的跨膜電壓發(fā)生變化?？缒る妷旱倪@種變化是否可以忽略，這種變化是否會影響甚至改變微秒脈沖電場的生物學(xué)效應(yīng)，迄今尚無定量研究，而這些問題正是微秒脈沖電場生物學(xué)效應(yīng)機(jī)理研究中所必須回答的問題。

為此，本研究基于目前廣泛采用的經(jīng)典球形單細(xì)胞五層介電模型［13，15，16］，仿真分析穿孔過程中由于細(xì)胞膜電導(dǎo)率的變化而導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)外膜跨膜電壓的變化規(guī)律，并由此探討穿孔過程中細(xì)胞膜電導(dǎo)率的變化對微秒脈沖電場生物學(xué)效應(yīng)的影響。最后，通過宮頸癌系 Hela的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證理論分析的正確性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞模型及內(nèi)外膜跨膜電壓的仿真計(jì)算

1.1.1 細(xì)胞模型

仿真計(jì)算中采用經(jīng)典球形單細(xì)胞五層介電模型，如圖1所示。圖中，E(t)為外加電場，箭頭方向?yàn)殡妶龇较?Rc和Rn分別為細(xì)胞及細(xì)胞核的半徑;dm和dn分別為細(xì)胞膜及細(xì)胞核膜的厚度;γnc、γnm、γc、γm、γo分別為核質(zhì)、核膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞外介質(zhì)的電導(dǎo)率;εnc、εnm、εc、εm、εo分別為核質(zhì)、核膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞介質(zhì)的介電常數(shù);θ為極軸方向和外加電場方向的夾角。假設(shè)球心為零電位。

圖1 球形單細(xì)胞五層介電模型Fig.1 Multilayer dielectric model of spherical cell

1.1.2 細(xì)胞內(nèi)外膜的跨膜電壓

當(dāng)外加時變電場E(t)作用于細(xì)胞懸液時，流過細(xì)胞各部分的電流由傳導(dǎo)電流和位移電流兩部分組成。根據(jù)全電流定律［18］，有

式中，

假設(shè)細(xì)胞上任意一點(diǎn)的電位為φ，則電場強(qiáng)度與電位有如下關(guān)系:

由于微分算子的引入將使時域中跨膜電壓的計(jì)算過程變得極為復(fù)雜。為簡化計(jì)算，對式(1)～式(3)進(jìn)行拉普拉斯變換，得到如下復(fù)頻域方程:

以球心為原點(diǎn)建立球坐標(biāo)系(r，θ，α)，聯(lián)立式(4)～式(6)，結(jié)合細(xì)胞五層介電模型各層分界面上電位連續(xù)和電流密度法向量連續(xù)的邊界條件，即可解得細(xì)胞內(nèi)、外膜的跨膜電壓。本研究僅選擇θ=0處細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜的跨膜電壓進(jìn)行分析。

1.1.3 跨膜電壓的仿真計(jì)算

細(xì)胞各部分的化學(xué)成分極為復(fù)雜，各部分的電參數(shù)有較大差異，同時，不同種類細(xì)胞的電參數(shù)也存在一定差異。為使仿真具有一般性，選擇國內(nèi)外文獻(xiàn)［13－16］中細(xì)胞參數(shù)的典型值作為仿真參數(shù)，如表1所示。

表1 細(xì)胞典型電參數(shù)Tab.1 Typical cell parameters

細(xì)胞膜發(fā)生電穿孔前，通常設(shè)定其電導(dǎo)率為1×10－5S/m，而當(dāng)發(fā)生穿孔即細(xì)胞膜上出現(xiàn)孔洞后，細(xì)胞膜的電導(dǎo)率將會增大，且其增幅與孔的尺寸和數(shù)量有關(guān)，文獻(xiàn)［17］曾報(bào)道當(dāng)細(xì)胞膜出現(xiàn)“孔洞”時，其電導(dǎo)率可激增幾倍甚至數(shù)十倍。因此，考慮選用3×10－4S/m(穿孔前的30倍)作為穿孔達(dá)一定程度時的細(xì)胞膜電導(dǎo)率，并由此來模擬分析穿孔過程中電導(dǎo)率的增加對細(xì)胞內(nèi)、外膜跨膜電壓的影響。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系為人宮頸癌細(xì)胞Hela(由重慶醫(yī)科大學(xué)超聲工程研究所提供)，貼壁生長，以RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含有10%的標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d傳代一次。取處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞，置10 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，用PBS平衡液洗滌2～3次，重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×106/mL，分裝在1.8 mL的EP管內(nèi)備用。以上細(xì)胞培養(yǎng)過程中所用培養(yǎng)基、血清及 PBS平衡液均為美國Hyclone公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為美國 GIBCO公司產(chǎn)品。

1.2.2 脈沖電場處理

實(shí)驗(yàn)裝置為重慶大學(xué)輸配電裝備與系統(tǒng)安全及新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行開發(fā)、研制的微秒脈沖發(fā)生器。該發(fā)生器輸出脈沖電壓峰值可達(dá)3 kV，上升時間為 ns級，脈寬為 μs級，重復(fù)頻率1～100 Hz，電壓峰值、脈沖寬度和重復(fù)頻率在取值范圍內(nèi)任意可調(diào)。實(shí)驗(yàn)時，將不可逆電穿孔腫瘤治療儀的輸出端與電極杯(美國BIO-RAD伯樂公司，電極間距為0.4 cm)的兩電極相連，輸出方波脈沖電場至Hela細(xì)胞懸液。

1.2.3 細(xì)胞凋亡的檢測

將實(shí)驗(yàn)分成8組，未施加脈沖電場的1組細(xì)胞懸液，為空白對照組。參照電穿孔脈沖電場的常規(guī)劑量［19］，其余 7組分別施加重復(fù)頻率 1 Hz、脈寬100 μs的 8個電場脈沖，場強(qiáng)依次為 750、1 000、1 250、1 500、1 750、2 000、2 250 V/cm。各實(shí)驗(yàn)組分別于處理后2 h加入Annexi V-FITC和PI(凋亡試劑盒購于美國BIO-RAD伯樂公司)，孵育10 min后送流式細(xì)胞儀。以FITC和PI熒光做雙參數(shù)點(diǎn)圖，將細(xì)胞分為四種:機(jī)械損傷細(xì)胞(Annexin V-/PI+)、正常細(xì)胞(Annexin V-/PI-)、早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI－)和晚期凋亡與壞死細(xì)胞(Annexin V+/PI+)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞內(nèi)外膜跨膜電壓的仿真結(jié)果

根據(jù)前述模型和仿真參數(shù)，基于 Matlab軟件(美國Mathworks公司)編寫相應(yīng)程序，選擇脈沖寬度為1 μs、幅值為1 000 V/cm的微秒方波脈沖電場作為外加電場進(jìn)行仿真。兩種不同細(xì)胞膜電導(dǎo)率下，細(xì)胞內(nèi)外膜的跨膜電壓波形如圖2所示。

由圖2可見，在微秒脈沖電場作用過程中及作用后，兩種情況下內(nèi)外膜跨膜電壓的變化趨勢大致相同。外膜跨膜電壓都經(jīng)歷一個由0增至最大值再減小到0的過程。內(nèi)膜跨膜電壓的變化較為復(fù)雜，脈沖電場作用后的短時間內(nèi)，內(nèi)膜跨膜電壓迅速增大至最大值，隨后緩慢減小并維持在某一大于0的數(shù)值。脈沖電場撤消瞬間，內(nèi)膜上的跨膜電壓迅速反向，然后該數(shù)值為負(fù)的內(nèi)膜跨膜電壓再緩慢變化至0。

然而，兩種情況下，跨膜電壓的數(shù)值以及內(nèi)、外膜跨膜電壓的相對大小有顯著差異。當(dāng)細(xì)胞膜電導(dǎo)率為1×10－5S/m時(圖2(a))，外膜跨膜電壓的最大值約1.3 V，內(nèi)膜上正向和反向跨膜電壓的最大值分別為0.6 V及－0.5 V，而當(dāng)細(xì)胞膜電導(dǎo)率為3×10－4S/m時(圖 2(b))，以上三個數(shù)值分別為0.4 V、0.62 V及 －0.1 V。特別是，當(dāng)細(xì)胞膜電導(dǎo)率為1×10－5S/m時，即未發(fā)生穿孔時，除了脈沖電場作用初期的約0.2 μs之外，外膜的跨膜電壓均明顯大于內(nèi)膜;而當(dāng)細(xì)胞膜電導(dǎo)率增加至3×10－4S/m，即細(xì)胞膜上出現(xiàn)一定數(shù)量的“孔洞”后，在脈沖電場作用的整個1 μs內(nèi)，內(nèi)膜電壓的數(shù)值始終大于外膜。

圖2 脈沖電場誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)外膜跨膜電壓。(a)細(xì)胞膜電導(dǎo)率1×10－5S/m;(b)細(xì)胞膜電導(dǎo)率3×10－4S/mFig.2 Transmembrane voltages induced by pulsed electric field for variations of membrane conductivity.(a)1 × 10－5S/m;(b)3 ×10－4 S/m

電穿孔程度不同，細(xì)胞膜電導(dǎo)率的大小有所差異。為進(jìn)一步直觀反映不同程度的電穿孔對細(xì)胞內(nèi)外膜跨膜電壓的影響，考慮不同大小的細(xì)胞膜電導(dǎo)率，按前述方法計(jì)算跨膜電壓，得到的細(xì)胞內(nèi)、外膜跨膜電壓的幅值之比如圖3所示?？梢?，隨著細(xì)胞膜電導(dǎo)率增加，即隨著穿孔程度加劇，內(nèi)、外膜跨膜電壓的比值持續(xù)增加，且當(dāng)細(xì)胞膜電導(dǎo)率大于1.8×10－4S/m 后，該比值大于1。

圖3 內(nèi)、外膜跨膜電壓的比值與細(xì)胞膜電導(dǎo)率的關(guān)系Fig.3 Ratios between internal and external transmembrane voltage vs.membrane conductivities

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

連接素Annexin V是一種相對分子質(zhì)量為35～36 kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞凋亡時翻轉(zhuǎn)到膜外的PS(正常細(xì)胞的PS處于膜內(nèi))高親和力特異性結(jié)合。標(biāo)記了異硫氰酸熒光素(FITC)的Annexin V可與凋亡細(xì)胞膜外的PS特異性結(jié)合而出現(xiàn)綠色熒光，但是單靠Annexin V-FITC無法區(qū)分凋亡細(xì)胞和細(xì)胞結(jié)構(gòu)已被破壞的壞死細(xì)胞。因此，還需結(jié)合能分辨細(xì)胞膜完整性的熒光染料PI。

根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)檢測的結(jié)果，得到如表2所示的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)?？梢?，隨外加脈沖電場場強(qiáng)的增加，即隨著電穿孔程度的不斷增加，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的早期凋亡比例隨之增大。從1 250 V/cm實(shí)驗(yàn)組開始，與對照組相比，處理組的凋亡率出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，且1 500 V/cm實(shí)驗(yàn)組的凋亡率與對照組和750 V/cm、1 000 V/cm實(shí)驗(yàn)組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，當(dāng)進(jìn)一步增加場強(qiáng)，伴隨著凋亡率增加的同時，壞死細(xì)胞比例亦明顯增加。

表2 脈沖電場致Hela細(xì)胞凋亡與壞死的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)Tab.2 Apoptosis statistical data by flow cytometry

3 討論

由前述的仿真分析可見，隨著細(xì)胞膜電導(dǎo)率增加，即隨著穿孔程度加劇，內(nèi)、外膜跨膜電壓的比值持續(xù)增加，且當(dāng)細(xì)胞膜電導(dǎo)率大于1.8×10－4S/m后，該比值大于1。由此可知，隨著細(xì)胞穿孔程度加劇，外加脈沖電場對胞內(nèi)細(xì)胞器膜的作用相對不斷增強(qiáng)，而對外膜(細(xì)胞膜)的作用則不斷減弱，即外加脈沖電場作用靶點(diǎn)逐漸由細(xì)胞外膜移到細(xì)胞內(nèi)膜，而這與現(xiàn)有研究認(rèn)為微秒脈沖難以透入細(xì)胞而對細(xì)胞器產(chǎn)生作用的觀點(diǎn)不一致［13－16］。

為驗(yàn)證理論分析的正確性，基于以下思路設(shè)計(jì)并開展了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。前期研究已經(jīng)證實(shí)［2，20］，細(xì)胞電穿孔的程度與外加脈沖電場的場強(qiáng)呈正相關(guān)，而穿孔程度的增加又會導(dǎo)致細(xì)胞膜電導(dǎo)率增大。因此，通過施加不同強(qiáng)度的脈沖電場，就可以模擬細(xì)胞膜電導(dǎo)率變化的情形。同時，前期研究也表明［12－14］，當(dāng)外加脈沖電場對細(xì)胞內(nèi)膜跨膜電壓的作用增強(qiáng)至一定程度時，將會使細(xì)胞器膜出現(xiàn)不可逆性過度開放并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。例如，線粒體膜的不可逆性過度開放，將會導(dǎo)致線粒體基質(zhì)滲透壓不斷升高，釋放出促凋亡蛋白，從而增大細(xì)胞發(fā)生凋亡的可能性。因此，前述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對于細(xì)胞凋亡率的檢測結(jié)果，可以說明外加脈沖電場對細(xì)胞內(nèi)膜的作用，從而在一定程度上反映穿孔過程中電導(dǎo)率變化對細(xì)胞內(nèi)外膜跨膜電壓的不同影響。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨外加脈沖電場場強(qiáng)的增加，即伴隨著細(xì)胞膜電導(dǎo)率的增加，各處理組細(xì)胞的早期凋亡率不斷增大。由此說明，在電穿孔過程中，隨著穿孔程度的不斷加劇，脈沖電場的作用靶點(diǎn)由細(xì)胞外膜逐漸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)膜，與仿真分析的結(jié)論一致。

此外，值得注意的是，隨著外加脈沖電場場強(qiáng)的增大，伴隨著凋亡率增加的同時，晚期凋亡和壞死細(xì)胞的比例逐漸增加。推測其原因，可能是當(dāng)外加脈沖電場強(qiáng)度繼續(xù)增加，外膜上孔洞大小將超過一定尺寸而無法愈合，即發(fā)生不可逆電穿孔現(xiàn)象，胞外基質(zhì)以及其他分子涌入細(xì)胞內(nèi)，最終導(dǎo)致細(xì)胞崩解壞死。

4 結(jié)語

考慮電穿孔過程中細(xì)胞膜電導(dǎo)率的變化，基于球形單細(xì)胞五層介電模型，對微秒脈沖電場作用下細(xì)胞內(nèi)外膜的跨膜電壓進(jìn)行了仿真研究。研究發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞穿孔程度加劇，細(xì)胞膜電導(dǎo)率不斷增加，導(dǎo)致脈沖電場對內(nèi)膜的作用不斷增強(qiáng)，即微秒脈沖電場的作用靶點(diǎn)透過細(xì)胞外膜而進(jìn)入了胞內(nèi)細(xì)胞器。同時，以人宮頸癌細(xì)胞系Hela為對象的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了仿真分析的結(jié)果。

現(xiàn)有研究大多認(rèn)為，微秒脈沖電場的生物學(xué)效應(yīng)主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜的電穿孔現(xiàn)象;而凋亡現(xiàn)象則是脈寬更小的納秒級脈沖電場所獨(dú)有的生物學(xué)效應(yīng)。本研究考慮了穿孔過程中細(xì)胞膜電導(dǎo)率的變化，仿真發(fā)現(xiàn)并用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了微秒脈沖電場對胞內(nèi)細(xì)胞器的作用以及由此引發(fā)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，在一定程度上豐富并拓展了現(xiàn)有的脈沖電場的生物學(xué)效應(yīng)理論。

需要注意的是，本研究采用了比較多的簡化條件，如假設(shè)細(xì)胞各部分均為簡單理想的均一介質(zhì)，穿孔后整個細(xì)胞膜的電導(dǎo)率均勻增加，等等。而事實(shí)上，細(xì)胞各部分的組成極為復(fù)雜，絕非均一介質(zhì)，而穿孔后細(xì)胞膜上的孔洞分布不均勻，膜上各處電導(dǎo)率的增加亦不一致。因此，為更加準(zhǔn)確地描述電穿孔過程中電導(dǎo)率變化所造成的影響尚需建立更為詳細(xì)的模型。

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