顏丕熙，李國(guó)新，吳曉剛，閆麗萍，滕巧泱，李澤君

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

2010年春季以來(lái)，上海市、江蘇省、浙江省、安徽省等地相繼爆發(fā)一種導(dǎo)致蛋鴨減產(chǎn)、生長(zhǎng)遲緩和死亡的一種新發(fā)病，研究證明引起該病的病原為坦布蘇病毒（Tembusu virus）[1,2]。該病毒可經(jīng)空氣傳播，對(duì)蛋鴨及肉鴨均有致病力。病鴨主要表現(xiàn)為高熱、運(yùn)動(dòng)障礙、食欲下降甚至廢絕、產(chǎn)蛋下降甚至停止，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡，死亡率可達(dá)5%～10%。剖檢可見(jiàn)脾臟明顯腫大；肝臟出血嚴(yán)重，伴有針尖狀白色壞死點(diǎn)；卵巢發(fā)生出血、萎縮、破裂，輸卵管有粘液[1,2]。由于該病毒為新發(fā)病原，目前尚無(wú)可靠的檢測(cè)方法。本研究組曾使用RT-PCR方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，但發(fā)現(xiàn)RT-PCR的敏感性比較差，不能有效的檢測(cè)出該病毒。近年來(lái)套式RTPCR在疾病的診斷方面顯示出靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)，在登革熱病毒[3]、蜱傳腦炎病毒[4]和西尼羅病毒[5]等黃病毒的檢測(cè)中都得到了很好應(yīng)用。鑒于此，本研究建立了套式RT-PCR方法，該方法能夠快速、敏感、特異地檢測(cè)出鴨坦布蘇病毒，為該病快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 鴨坦布蘇病毒的增殖 鴨坦布蘇病毒（FX2010）由本研究室分離鑒定。取保存的病毒液100 μL接種9日齡SPF雞胚，收集24～120 h死亡雞胚胚體，胚體研磨后，7500×g離心30 min，吸取上清，滴定病毒含量后，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)坦布蘇病毒（FX2010）E基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性的重疊引物（表1），引物由上海Invitrogen公司合成，用DEPC水稀釋至終濃度為10 μmol/L，分裝后凍存于-20℃。

1.3 病毒RNA的提取 取1.5 mL Eppendorf管，向其內(nèi)加入500 μL上述病毒液、800 μL Trizol(Invitrogen)，靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，振蕩15 s，靜置2～3 min；4℃離心10 min，吸取上清并加入等體積的異丙醇，沉淀10 min；4℃ 10 800×g離心10 min，棄上清，用75%酒精清洗沉淀，混勻后，10 800×g離心10 min；倒掉上清，RNA自然干燥，用20 μL DEPC水溶解RNA。

1.4 反轉(zhuǎn)錄 將5μL RNA提取液與2 μL Random 9（TaKaRa）混勻，70 ℃保溫10 min，迅速冰浴2 min，然 后 分 別 加 入 4 μL 5×AMV Buffer、1μL RRI、1μL AMV（Takara）、1 μL 10 umol/L dNTP、6 μL DEPC水，共20 μL，混勻后30 ℃保溫10 min，42 ℃1 h，75 ℃ 10 min。

1.5 套式RT-PCR方法的建立 第一輪PCR采用25 μL反應(yīng)體系：12.5 μL PCR Mix（東盛生物），1 μL P1（10 umol/L），1 μL P2（10 umol/L），1 μL cDNA模板，滅菌ddH2O補(bǔ)加至25 μL。置于PCR儀中，94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，53℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。第二輪PCR采用25 μL體系：取第一輪PCR反應(yīng)液1 μL為模板，12.5 μL PCR Mix、1 μL P3（10 umol/L）、1 μL P4（10 umol/L），滅菌ddH2O補(bǔ)加至25 μL，置于PCR儀中。94 ℃預(yù)變性 4 min；94℃變形 30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.6 套式RT-PCR與普通PCR敏感性比較 取病毒液進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)ū?）。每個(gè)稀釋度取200 μL按上述方法進(jìn)行RNA提取及反轉(zhuǎn)錄，所獲得的cDNA取1 μL作為模板，用引物P1、P2進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳檢測(cè)。以第一次PCR產(chǎn)物（1μL）為模板，用引物P3、P4進(jìn)行套式RT-PCR擴(kuò)增。同時(shí)利用1μL cDNA作為模板，用引物P3、P4進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 特異性實(shí)驗(yàn) 以禽流感病毒、新城疫病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒、鴨肝炎病毒等病毒的核酸反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，按上述方法對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每次擴(kuò)增設(shè)雙蒸水作陰性對(duì)照，鴨坦布蘇病毒反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板作為陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后用凝膠電泳檢測(cè)。

1.8 臨床應(yīng)用 從安徽省、河北省、山東省、 浙江省、上海市等地發(fā)病鴨場(chǎng)采取病鴨脾臟組織，按1g/mL PBS加入PBS進(jìn)行研磨，4℃ 10 800×g離心10 min。取200 μL上清按上述方法提取病毒RNA及反轉(zhuǎn)錄，隨后進(jìn)行套式RT-PCR檢測(cè)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。將陽(yáng)性病料接種8日齡SPF鴨胚后分離該病毒，并應(yīng)用該套式RT-PCR方法對(duì)分離病毒的鴨胚尿囊液進(jìn)行檢測(cè)，以確定病毒分離結(jié)果。

表1 PCR擴(kuò)增所需特異性引物Table1 The specific primers for PCR amplication

2 結(jié)果

2.1 套式RT-PCR與普通PCR敏感性的比較 將毒價(jià)為105.25ELD50/100 μL的病毒液做10倍系列稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度取200 μL提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后取1 μL（見(jiàn)表2）為模板，進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。凝膠電泳結(jié)果顯示，只有毒價(jià)為2×105.25/100μL的病毒可以獲得962 bp的目的條帶（圖1A）。用引物P3和P4進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，結(jié)果顯示，毒價(jià)為2×103.25/100 μL的病毒可以獲得300 bp的目的條帶（圖1A）。而直接用引物P3和P4進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，病毒滴度達(dá)到2×104.25/100 μL時(shí)才可獲得特異條帶（圖2）。結(jié)果表明套式RT-PCR擴(kuò)增的敏感性較常規(guī)的PCR方法高10倍 （表2）。

表2 套式RT-PCR的敏感性Table 2 Sensitivity comparison between nested RT-PCR assay and RT-PCR

2.2 套式RT-PCR的特異性 以禽流感病毒、新城疫病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒、鴨肝炎病毒等病毒的核酸反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，同時(shí)以雙蒸水作陰性對(duì)照，以鴨坦布蘇病毒做陽(yáng)性對(duì)照，按上述方法對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖3。試驗(yàn)結(jié)果顯示此PCR反應(yīng)對(duì)鴨坦布蘇病毒具有特異性。

2.3 臨床樣品檢測(cè) 應(yīng)用該套式RT-PCR方法對(duì)浙江省、上海市、山東省、河北省、安徽省等送檢的病料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果陽(yáng)性病料可獲得了300 bp的目的片段，陽(yáng)性檢出率為48/63，與病毒分離率為13/63，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 臨床樣品檢測(cè)Table 3 The detection of clinical samples by nested RT-PCR

3 討論

鴨坦布蘇病毒是2010年新發(fā)現(xiàn)的一種病毒。目前所知，該病毒主要侵害鴨，尤其是蛋鴨，可使蛋鴨采食量下降、生長(zhǎng)遲緩、體重下降、產(chǎn)蛋減少甚至停止，并能導(dǎo)致一定的死亡率。剖檢病理特征主要是脾臟腫大、腎臟腫大、嚴(yán)重者肝臟后期有針尖狀白色壞死點(diǎn)等。該病毒的致病特點(diǎn)和機(jī)理目前尚不十分清楚。目前中國(guó)多數(shù)地區(qū)都遭受該病的影響，給蛋鴨養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了極大的損失。

對(duì)于該病的診斷，采用傳統(tǒng)的病毒分離方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且敏感性低。本研究建立了RT-PCR方法和套式RT-PCR方法檢測(cè)該病毒，并對(duì)兩種方法的敏感性作了比較。結(jié)果顯示，套式RT-PCR方法比RT-PCR方法1（引物P1、P2）敏感性高100倍，比RT-PCR方法2（引物P3、P4）敏感性高10倍。在特異性試驗(yàn)中陽(yáng)性病料可獲得300 bp的目的條帶，而禽流感病毒、新城疫病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒、鴨肝炎病毒等的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，表明該方法具有良好的特異性。應(yīng)用該套式RT-PCR對(duì)臨床病料進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果表明該套式RT-PCR是檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的有效手段，可用于鴨坦布蘇病毒的臨床診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查。同時(shí)，應(yīng)用該方法可以對(duì)病毒分離進(jìn)行檢測(cè)與驗(yàn)證。綜上所述，本研究所建立的套式RT-PCR能快速、靈敏、特異地檢測(cè)出鴨坦布蘇病毒，將為該病的防治與防控發(fā)揮重要作用。

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