楊月峰，王華，肖鳳君，徐潔，李慶芳，嚴(yán)俊，王立生

我國(guó)前列腺癌（prostate cancer，PC）的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，悄悄影響著老年人口的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命[1-2]。PC 的發(fā)病與機(jī)體免疫抑制或耐受相關(guān)，包括特異性和非特異性免疫被阻斷[3]。而抗原遞呈功能不足是導(dǎo)致腫瘤患者免疫抑制狀態(tài)的最重要因素，以致即使產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞，也很難識(shí)別和殺死腫瘤細(xì)胞[4]。樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是已知體內(nèi)功能最強(qiáng)、唯一能活化靜息 T 細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞，是啟動(dòng)、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。目前，通過(guò)多種策略制備的 DC疫苗取得了令人鼓舞的結(jié)果[5-7]。

CD40-CD40L 是特異性免疫反應(yīng)系統(tǒng)的一對(duì)重要共刺激分子。研究表明，CD40L 與腫瘤抗原融合表達(dá)，能通過(guò) CD40L 的靶向作用將腫瘤抗原帶到 DC 表面，進(jìn)而激活機(jī)體特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)[8]。而粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）能有效促進(jìn) DC 的成熟和分化[9]。本研究將構(gòu)建攜帶融合蛋白基因 PSA-IZ-mCD40L（PmL）和 GM-CSF基因的重組質(zhì)粒載體 pUDK-PmL-IR-GM，并探討其小鼠體內(nèi)免疫激活作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康二級(jí) Balb/c 雄性小鼠20 只，4～6 周齡，體重：（21.32±2.19）g。由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK-（軍）2007-004，飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.1.2 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞 pUDK 為本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)并構(gòu)建的基因治療質(zhì)粒載體；pUDK-HmLIR-GM 為攜帶乙肝病毒（HBV）抗原多肽、mCD40L融合蛋白基因和 GM-CSF 基因的質(zhì)粒載體；pUDK-mL-IR-GM 為攜帶 mCD40L 和 GM-CSF 基因的質(zhì)粒載體；TE-SV-IR-TP-55K 為攜帶人源 GM-CSF（hGM-CSF）基因的 T 載體，以上質(zhì)粒載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存。DH5a 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博大泰克；人 PC 細(xì)胞系 LNCaP 購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)；人肝癌細(xì)胞系 HepG2 為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 工具酶及主要試劑 限制性內(nèi)切酶 ApaI、KpnI、EcoRV、BglII、EcoRI、NotI 和 XbaI，λ-HindIII Marker 購(gòu)自日本 TaKaRa 公司；高保真 DNA 聚合酶 KOD-Plus 試劑盒購(gòu)自日本 TOYOBO 公司；T4 DNA 連接酶購(gòu)自美國(guó) NEB 公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒 M-MLV、脂質(zhì)體 2000、D2000 Marker、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒購(gòu)自北京 TIANGen 公司；ConA、MTT、RPMI1640 和 DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；FBS 購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司和北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；G418 購(gòu)自德國(guó) Merck 公司；流式檢測(cè)抗體 PE-anti-CD3、FITC-anti-CD4、APC-anti-CD8 和 PE-anti-B220 購(gòu)自美國(guó) Biolegend 公司；人 GM-CSF ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京晶美公司；Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；細(xì)胞殺傷檢測(cè)試劑盒 CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay 購(gòu)自美國(guó) Promega 公司；羊抗鼠 CD40L 抗體購(gòu)自美國(guó) R&D 公司，兔抗山羊二抗購(gòu)自北京中杉公司；引物合成及測(cè)序均由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 前列腺特異性抗原與 mCD40L 的融合蛋白基因 PmL 的克隆 采用 Trizol 法提取人前列腺癌細(xì)胞 LNCaP 和小鼠 T 淋巴細(xì)胞的 RNA，分別采用 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA，并以其為模板，PCR 分別擴(kuò)增前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）基因和鼠源性CD40 配體（mouse CD40 ligand，mCD40L）基因。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 2min；95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，68℃延伸 1min，30 個(gè)循環(huán)；68℃延伸 10min；22℃1min。同時(shí)，采用基因合成的方法合成含有異亮氨酸拉鏈（isoleucine zipper，IZ）的連接序列 linker，具體為：將引物IZ1-IZ6 混合后，取 1.0 μl 作為模板，采用重疊PCR 的方法，先擴(kuò)增 10 個(gè)循環(huán)，再分別加入 0.5 μl引物 IZ1 和引物 IZ6，繼續(xù)擴(kuò)增 20 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增條件同上。所需引物如表1 所示。

表1 PSA-IZ-mCD40L 融合蛋白基因的相關(guān)引物Table 1 Primers for construction of fusion protein gene PSA-IZ-mCD40L

將得到的基因片段 PSA、linker、mCD40L 割膠回收純化后，將其按照摩爾比 1∶3∶1 混合，在不加引物條件下擴(kuò)增 10 個(gè)循環(huán)。然后加入 PSA上游引物和 mCD40L 下游引物，PCR 擴(kuò)增全長(zhǎng)融合蛋白基因 PmL（PSA-IZ-mCD40L）。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 2min；95℃變性 30 s，60℃退火30 s，68℃延伸 2min，30 個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min；22℃1min。

1.2.2 重組質(zhì)粒 pUDK-PmL-IR-GM 的構(gòu)建 以TE-SV-IR-TP-55K 為模板，PCR 擴(kuò)增獲取目的基因 hGM-CSF（上游：5’ CCCAGCGGCCGCGGATG TGGCTGCAGAGCCTGCTG 3’；下游：5’ GCCGTC TAGATCACTCCTGGACTGGCTCCCA 3’；擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 2min；95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，68℃延伸 30 s，30 個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min；22℃1min）。質(zhì)粒載體 pUDK 與 GMCSF 基因分別進(jìn)行 NotI 和 XbaI 雙酶切后，T4 DNA 連接酶于 24℃連接 2 h，轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，Kana+ LB 平板篩選陽(yáng)性克隆 pUDK-GM，并經(jīng)酶切鑒定正確。

融合蛋白基因 PmL 進(jìn)行 KpnI 和 EcoRI 雙酶切后，克隆到 pUDK-GM 的相應(yīng)位點(diǎn)，Kana+ 篩選陽(yáng)性克隆 pUDK-PmL-GM。NotI 和 EcoRI 雙酶切 pUDK-HmL-IR-GM 獲取核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry sites，IRES）基因，并將其克隆到 pUDK-PmL-GM 的相應(yīng)位點(diǎn)，Kana+ 篩選陽(yáng)性克隆 pUDK-PmL-IR-GM，經(jīng)酶切鑒定正確后，測(cè)序鑒定正確。

對(duì)于廣大網(wǎng)球運(yùn)動(dòng)員的專項(xiàng)體能訓(xùn)練，應(yīng)確保他們訓(xùn)練內(nèi)容與實(shí)際比賽需求相吻合，必須要結(jié)合具體訓(xùn)練目標(biāo)，只有這樣，才能真正發(fā)揮出專項(xiàng)體能訓(xùn)練的積極作用。假設(shè)專項(xiàng)體能訓(xùn)練內(nèi)容與實(shí)際網(wǎng)球比賽規(guī)定相違背，將會(huì)直接并且嚴(yán)重地影響運(yùn)動(dòng)員的比賽成績(jī)。例如，在實(shí)施耐力方面的訓(xùn)練時(shí)，應(yīng)盡可能確保在網(wǎng)球訓(xùn)練場(chǎng)地、有球拍和球的狀況下進(jìn)行，這樣能夠加強(qiáng)集體訓(xùn)練項(xiàng)目與網(wǎng)球運(yùn)動(dòng)員真實(shí)技術(shù)水平之間的緊密性，同時(shí)還能讓運(yùn)動(dòng)員感受到真實(shí)比賽的氛圍。在日常專項(xiàng)體能訓(xùn)練中，應(yīng)讓網(wǎng)球運(yùn)動(dòng)員體會(huì)到真實(shí)比賽中所需的強(qiáng)度、力度以及節(jié)奏，這將能夠充分鍛煉運(yùn)動(dòng)員臨場(chǎng)發(fā)揮的能力。

1.2.3 重組質(zhì)粒 pUDK-PmL-IR-GM 的鑒定 采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式將重組質(zhì)粒 pUDK-PmL-IRGM、對(duì)照質(zhì)粒 pUDK-mL-IR-GM 和 pUDK- EGFP轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞；并采用 G418 篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。分別收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清，并采用 ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè) GM-CSF 的表達(dá)；同時(shí)，提取細(xì)胞蛋白，采用羊抗鼠 CD40L 抗體檢測(cè)目的蛋白 PmL 和 mCD40L 的表達(dá)。

1.2.4 動(dòng)物分組、給藥方式及免疫細(xì)胞分離 將小鼠隨機(jī)分為PBS 組、pUDK 組、pUDK-PmL-IRGM 組和 pUDK-mL-IR-GM 組，每組 5 只。分別于第1、11、21 和 35 天進(jìn)行免疫，每次給予 50 μg質(zhì)粒/200 μl，PBS 組給予 200 μl PBS，分別于小鼠右側(cè)后腿肌肉分點(diǎn)注射。

小鼠脾臟是重要的免疫器官，含有豐富的免疫細(xì)胞，包括 T 淋巴細(xì)胞和 B 淋巴細(xì)胞，而尼龍毛能夠有效吸附 B 淋巴細(xì)胞。末次免疫后 10 d 處死小鼠，尼龍毛法分離小鼠脾臟 T 淋巴細(xì)胞。具體為：于超凈臺(tái)取小鼠脾臟組織研磨，收集細(xì)胞后裂解紅細(xì)胞，并重懸于 5%FBS 的 1640 培養(yǎng)基中，將其加入到尼龍毛柱（已用 5%FBS 的 1640 培養(yǎng)基平衡）中，室溫靜置 30min 后，讓液體自然流出并洗滌，收集流出液和洗滌液中的細(xì)胞，即可得到小鼠 T 淋巴細(xì)胞。

1.2.5 小鼠 T 淋巴細(xì)胞免疫功能分析 為檢測(cè)T 淋巴細(xì)胞的純度及融合蛋白對(duì)小鼠 T 淋巴細(xì)胞的激活作用，一組細(xì)胞標(biāo)記 PE-anti-B220 抗體；另一組細(xì)胞同時(shí)標(biāo)記 PE-anti-CD3 抗體，F(xiàn)ITC-anti-CD4 抗體 和 APC-anti-CD8 抗體。然后，流式細(xì)胞分別檢測(cè) B、T 淋巴細(xì)胞的含量，CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞的含量及比值的改變。

將分離得到的小鼠脾臟 T 淋巴細(xì)胞以 3×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于 96 孔板，然后分別采用conA（陽(yáng)性對(duì)照組），培養(yǎng)基（陰性對(duì)照組）和LNCaP 細(xì)胞培養(yǎng)上清（實(shí)驗(yàn)組）進(jìn)行刺激，培養(yǎng) 4 d后，MTT 法檢測(cè)各組 T 淋巴細(xì)胞的增殖能力。

分離得到的小鼠 T 淋巴細(xì)胞，用 LNCaP 細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育 4 d 后，采用 CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay 試劑盒分別檢測(cè)其在不同的效靶比情況下，對(duì) LNCaP 細(xì)胞和 HepG2細(xì)胞的特異性殺傷作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SAS 8.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。定量資料以±s表示，整體比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒載體 pUDK-PmL-IR-GM 的構(gòu)建

圖1 重組質(zhì)粒 pUDK-PmL-IR-GM 的構(gòu)建Figure 1 Construction of recombinant plamid pUDK-PmLIR-GM

圖2 重組質(zhì)粒 pUDK-PmL-IR-GM 結(jié)構(gòu)示意圖Figure 2 Diagram of recombinant plamid PUDK-PmL-IRGM

然后，分步將目的基因 hGM-CSF、PmL、IRES依次克隆到相應(yīng)位點(diǎn)，分別得到中間載體 pUDKGM 和 pUDK-PmL-GM，并最終成功篩選獲得目的載體 pUDK-PmL-IR-GM，經(jīng)酶切鑒定正確后，測(cè)序鑒定正確（圖1B 和圖2）。

2.2 質(zhì)粒載體 pUDK-PmL-IR-GM 蛋白表達(dá)水平鑒定

為檢測(cè)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染條件下目的蛋白的表達(dá)情況，將 pUDK-PmL-IR-GM、對(duì)照質(zhì)粒 pUDK-mLIR-GM 以及 pUDK-EGFP 分別以脂質(zhì)體方式轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞后，G418 篩選，14 d 后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，其中 pUDK-EGFP 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其綠色熒光蛋白的表達(dá)效率達(dá)到 95%以上。

分別提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白和培養(yǎng)上清，采用 Western blot 和 ELISA 檢測(cè)目的蛋白 PmL（或mL）和 GM-CSF 的表達(dá)。結(jié)果顯示，pUDK-PmLIR-GM 和 pUDK-mL-IR-GM 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，能夠表達(dá)與羊抗鼠 CD40L 抗體結(jié)合的蛋白，其大小分別為50 kD 和 35 kD 左右。ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，pUDK-PmL-IR-GM 和 pUDK-mL-IR-GM 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有大量的 GM-CSF。上述結(jié)果表明，目的載體 pUDK-PmL-IR-GM 能夠在細(xì)胞水平有效表達(dá)融合蛋白 PmL 和 GM-CSF（圖3）。

圖3 pUDK-PmL-IR-GM 的蛋白水平鑒定Figure 2 Identification of the protein expressed by pUDKPmL-IR-GM

2.3 小鼠 T 淋巴細(xì)胞的分離及純度鑒定

小鼠末次免疫后 10 d，處死小鼠，并采用尼龍毛柱去除 B 淋巴細(xì)胞，得到純度較高的 T 淋巴細(xì)胞。流式檢測(cè)結(jié)果顯示，B 淋巴細(xì)胞的含量在 10%左右，而 CD3+T 淋巴細(xì)胞的含量均高于 80%，符合進(jìn)一步功能實(shí)驗(yàn)的要求（圖4）。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分離得到細(xì)胞的純度（A：B 淋巴細(xì)胞；B：T 淋巴細(xì)胞）Figure 4 Purity of cells isolated from the spleen of mice (A: B lymphocytes; B: T lymphocytes)

2.4 pUDK-PmL-IR-GM 免疫對(duì)小鼠 T 淋巴細(xì)胞功能的影響

為評(píng)價(jià) pUDK-PmL-IR-GM 對(duì)小鼠 T 淋巴細(xì)胞的激活作用，分別對(duì) T 淋巴細(xì)胞亞群的改變、T 淋巴細(xì)胞增殖能力及 PC 細(xì)胞的特異性殺傷作用進(jìn)行檢測(cè)。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟 T 淋巴細(xì)胞亞群（A：T 淋巴細(xì)胞亞群含量；B：T 淋巴細(xì)亞群比值，*與 PBS 組相比，P＜0.05）Figure 5 Assay subtypes of T lymphocytes by flow cytometry (A: Percentage of T lymphocyte subsets; B: The ratio of T lymphocyte subsets, *Compared with the PBS group,P＜0.05)

2.4.1 對(duì) T 淋巴細(xì)胞亞群的影響 CD4+T 淋巴細(xì)胞比例升高以及 CD4+T/CD8+T 值升高是機(jī)體免疫激活的重要標(biāo)志。分離得到的脾臟 T 淋巴細(xì)胞分別標(biāo)記 PE-anti-CD3，F(xiàn)ITC-anti-CD4 和 APC-anti-CD8 后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，pUDKPmL-IR-GM 免疫后，小鼠 CD4+T 淋巴細(xì)胞的比例有升高的趨勢(shì)；而 CD4+T/CD8+T 值明顯升高，且與對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖5）。結(jié)果表明，pUDK-PmL-IR-GM 免疫后，小鼠處于一定的免疫激活狀態(tài)。

2.4.2 對(duì) T 淋巴細(xì)胞增殖能力的影響 T 淋巴細(xì)胞增殖，是機(jī)體應(yīng)對(duì)外源刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要環(huán)節(jié)。將分離得到的脾臟 T 淋巴細(xì)胞與含有PSA 抗原的 LNCaP 細(xì)胞培養(yǎng)上清共同孵育，MTT檢測(cè)其增殖能力。結(jié)果顯示，PSA 抗原刺激能夠明顯增強(qiáng) pUDK-PmL-IR-GM 組 T 淋巴細(xì)胞的增殖能力（P＜0.05）；而且，PSA 抗原作用后，pUDKPmL-IR-GM 組 T 淋巴細(xì)胞的增殖能力明顯高于PBS、pUDK 以及 pUDK-mL-IR-GM 組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖6）。上述結(jié)果表明，pUDK-PmL-IR-GM 免疫可增強(qiáng)小鼠 T 淋巴細(xì)胞應(yīng)對(duì) PSA 的特異性增殖作用。

圖6 MTT 法檢測(cè)小鼠 T 淋巴細(xì)胞的增殖（a與陰性對(duì)照相比，P＜0.01；b與 PBS 免疫小鼠的 PSA 上清組比，P＜0.01；c與 pUDK 免疫小鼠的 PSA 上清組比，P＜0.01；d與pUDK-mL-IR-GM 免疫小鼠的 PSA 上清組比，P＜0.01）Figure 6 Assay proliferation ability of T lymphocytes from mice by MTT (aCompared with the negative control,P＜0.01;bCompared with the cells from PBS group which stimulated by PSA,P＜0.01; cCompared with the cells from pUDK group which stimulated by PSA,P＜0.01; dCompared with the cells from PUDK-mL-IR-GM group which stimulated by PSA,P＜0.01)

圖7 小鼠 T 淋巴細(xì)胞對(duì) LNCaP 細(xì)胞的殺傷效應(yīng)（*與pUDK 免疫組相比，P＜0.05）Figure 7 Assay effect of LNCap cells killed by T lymphocytes from mice (*Compared with the pUDK group,P＜0.05)

2.4.3 對(duì) T 淋巴細(xì)胞特異性殺傷作用的影響 小鼠脾臟 T 淋巴細(xì)胞與 PSA 抗原共孵育 4 d，使其進(jìn)一步激活后，以其作為效應(yīng)細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)LNCaP 細(xì)胞和 HepG2 細(xì)胞的特異性殺傷作用。結(jié)果顯示，在效靶比為5∶1 時(shí)，pUDK-PmL-IR-GM免疫小鼠的 T 淋巴細(xì)胞對(duì) LNCaP 的殺傷效率能夠達(dá)到 25%以上，明顯高于對(duì)照組，且與 pUDK免疫組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖7）；同時(shí)，在不同效靶比條件下，其對(duì)肝癌細(xì)胞 HepG2沒(méi)有明顯的殺傷作用。表明免疫后小鼠的 T 淋巴細(xì)胞具有一定的特異性殺傷效應(yīng)。

3 討論

前列腺癌的發(fā)病與機(jī)體的免疫功能障礙相關(guān)，包括 NK、T 淋巴細(xì)胞和 DC 細(xì)胞的活化被阻斷等。目前認(rèn)為，前列腺癌逃避免疫的機(jī)制與腫瘤細(xì)胞表面分子[包括主要組織相容性復(fù)合體（MHC）I 類分子、腫瘤抗原、共刺激分子等]的缺失相關(guān)，腫瘤細(xì)胞分泌的可溶性抗原能夠中和機(jī)體產(chǎn)生的抗體。此外，一些免疫抑制相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，使得腫瘤局部或全身抗腫瘤免疫反應(yīng)受到抑制[3]。

作為特異性免疫反應(yīng)系統(tǒng)的一對(duì)重要共刺激分子，CD40-CD40L 在 T 細(xì)胞活化以及效應(yīng)性細(xì)胞因子的分泌過(guò)程中起著重要調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)，CD40L 在腫瘤基因治療的應(yīng)用研究不斷深入。研究表明，CD40L 導(dǎo)入對(duì)胰腺癌、惡性黑色素瘤、轉(zhuǎn)移性肝癌、肺癌以及卵巢癌都具有一定的療效[10-14]。有研究表明，將 CD40L 與腫瘤抗原融合表達(dá)，能夠通過(guò) CD40L 的靶向作用將腫瘤抗原帶到 DC 表面，進(jìn)而更加有效地將腫瘤抗原加工處理，并遞呈給 T 淋巴細(xì)胞[8]。在抗原加工處理和遞呈過(guò)程中，DC 的成熟是關(guān)鍵，而 GM-CSF 能夠促進(jìn) DC 的成熟和分化[9]。因此，CD40L 與腫瘤抗原融合表達(dá)結(jié)合 GM-CSF 能更加有效地激活機(jī)體的免疫反應(yīng)。

本研究首先構(gòu)建了含有 PSA 與 mCD40L 的融合蛋白基因，以及 GM-CSF 基因的質(zhì)粒載體pUDK-PmL-IR-GM，并對(duì)其激活小鼠 T 淋巴細(xì)胞特異性免疫的作用進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，融合蛋白和 GM-CSF 的聯(lián)合應(yīng)用，能夠從一定程度激活小鼠 T 淋巴細(xì)胞，包括 CD4+T 淋巴細(xì)胞與CD8+T 淋巴細(xì)胞比值升高；PSA 刺激可促進(jìn) T 淋巴細(xì)胞增殖；以及激活 T 淋巴細(xì)胞針對(duì) PSA 抗原的特異性免疫反應(yīng)等。結(jié)果表明，pUDK-PmL-IRGM 能在一定程度激活小鼠針對(duì) PSA 的特異性免疫反應(yīng)，從而為進(jìn)一步應(yīng)用于 PC 免疫基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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