王身艷，余黎，蔣亞平，陳建偉

雙向固體發(fā)酵技術(shù)是南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究中心莊毅教授于 20 世紀(jì) 80年代創(chuàng)立的一種新型的中藥發(fā)酵技術(shù)。它采用藥用真菌發(fā)酵具有活性成分的中藥，產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生理活動(dòng)和生化效應(yīng)，無需將藥用真菌與次級(jí)代謝產(chǎn)物分離，兩者共同使用，協(xié)同發(fā)揮藥效[1]。中藥發(fā)酵的目的主要為了增強(qiáng)藥效、發(fā)現(xiàn)新的治療作用、減毒解毒、擴(kuò)大用藥品種等。如潘揚(yáng)等[2]采用藥用真菌對(duì)馬錢子進(jìn)行雙向發(fā)酵，結(jié)果表明，和空白對(duì)照相比，士的寧、馬錢子堿的含量均呈下降的趨勢(shì),而士的寧氮氧化物、馬錢子堿氮氧化物有不同程度的增加，毒性明顯降低，藥效增強(qiáng)。鑒于草烏毒性大，臨床效果好，筆者對(duì)草烏用藥用真菌進(jìn)行了雙向固體發(fā)酵。

草烏（Radix aconiti kusnezoffii）為毛茛科植物北烏頭（Aconitum kusnezoffiiReichb.）的干燥母根。草烏臨床應(yīng)用已有幾千年的歷史，多具祛風(fēng)除濕、溫中止痛之功效。草烏藥材中主要含烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿等雙酯型生物堿。其雙酯型生物堿既是毒性成分，也是活性成分,但性質(zhì)不穩(wěn)定,遇水加熱則容易水解成毒性較小的苯甲酰單酯型生物堿及親水性氨基醇類烏頭原堿?，F(xiàn)在烏頭的炮制方法過分強(qiáng)調(diào)解毒，而忽視烏頭的功效特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過雙向固體發(fā)酵技術(shù)對(duì)草烏進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化研究，以期達(dá)到去毒存（增）效的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑 島津 LC-10AT HPLC系統(tǒng)、LC-10ATAB 雙泵、SPD-10A 紫外檢測(cè)器、ERC-3415 自動(dòng)脫氣機(jī)、AT-5300 OVEN 柱溫箱均為日本島津公司產(chǎn)品；METTLER AE240 電子天平為瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)產(chǎn)品；SYZ-550 型石英亞沸高純水蒸餾器為江蘇金壇國(guó)勝儀器廠產(chǎn)品；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋為江蘇國(guó)華儀器廠產(chǎn)品；R-124 型抽濾泵為瑞士 BUCHI 公司產(chǎn)品。色譜純乙腈為美國(guó) TEDIA 公司產(chǎn)品；水為雙蒸水；其他試劑為分析純，均購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司；烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110720-200410）、中烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：0799-9403）、次烏頭堿（批號(hào)：0798-9403）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.1.2 “藥性基質(zhì)”的來源 草烏購(gòu)自南京市藥材公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王春根教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物北烏頭（Aconitum kusnezoffii Reichb.）的干燥母根。

1.1.3 真菌菌株的選擇 根據(jù)以往雙向固體發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)，首選槐耳（Trametes robiniophilaMurr.）、靈芝[Ganoderma lucidum(Leyss.) Karst]等 10 個(gè)經(jīng)過菌株鑒定的藥用真菌（菌株代號(hào)分別為A、Q、V、D、E、F、H、SW、O①、い，由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所保藏）作為在草烏“藥性基質(zhì)”上進(jìn)行生長(zhǎng)條件篩選試驗(yàn)的菌株。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種雄性小鼠 100 只，6～8 周齡，體重（20±2）g，購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[合格證號(hào)：SYXK（蘇）2007-0030]，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 SPF 級(jí)動(dòng)物房。

1.2 方法

1.2.1 草烏“藥性菌質(zhì)”的培養(yǎng) 在一定的生物技術(shù)控制下，運(yùn)用“固體雙向發(fā)酵”技術(shù)，用槐耳、靈芝、紅栓等真菌發(fā)酵草烏，根據(jù)真菌與基質(zhì)組合的發(fā)酵情況，即菌株能否與草烏（藥性基質(zhì)）相適應(yīng)而正常生長(zhǎng)為指標(biāo)，發(fā)酵后從“藥性基質(zhì)”中獲得 11 個(gè)草烏的“藥性菌質(zhì)”樣品，其中有 1 個(gè)為空白對(duì)照（未經(jīng)發(fā)酵）樣品。在菌絲體生長(zhǎng)一段時(shí)間后，取出各真菌發(fā)酵后的“藥性菌質(zhì)”，低溫干燥，即得。并計(jì)算菌質(zhì)得率：菌質(zhì)得率（%）= 藥性菌質(zhì)干重（g）/藥性基質(zhì)干重（g）×100%。

1.2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱定烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿分別為1.4 mg、3.1 mg、3.9 mg，用乙腈定容至 5 ml，放置冰箱保存，備用。

1.2.3 供試品溶液的配制 取樣品粉末 1.0 g，精密稱定，置 50 ml 具塞燒瓶中，加入適量氨試液潤(rùn)濕，再加入 20 ml 乙醚，靜置 24 h，超聲提取30min，濾過，40℃水浴揮干，滴加乙腈試液，定容至 2 ml。

1.2.4 HPLC 的測(cè)定條件 固定相：Akzo Nobel Kromasil C18色譜柱（4.6mm×250mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 為緩沖液（0.2%冰醋酸用三乙胺調(diào)節(jié)pH 至 6.20）；B 為乙腈。梯度洗脫，洗脫程序見表1。進(jìn)樣量：10 μl；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；柱溫：30℃；分析時(shí)間 85min。

1.2.5 樣品含量變化分析及烏頭堿類化合物指紋圖譜的建立 取不同真菌發(fā)酵的草烏藥性菌質(zhì)，按上述 HPLC 條件與方法測(cè)定樣品中烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿的含量變化和烏頭的指紋譜差異。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The mode of gradient elution

1.2.6 各草烏菌質(zhì)對(duì)昆明種小鼠鎮(zhèn)痛作用 取體重 18～22 g 雄性小鼠 50 只，按體重隨機(jī)分為5 組，每組 10 只，分別為發(fā)酵空白組、草烏 + O①組、草烏 + A 組、草烏 + V 組、草烏 + F 組，按生藥計(jì)給藥量均為6 g/kg。灌胃給藥，每日一次，連續(xù) 3 d。末次給藥后 1 h，每只小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸 0.1 ml/10 g，觀察記錄注射后 15min內(nèi)各組扭體發(fā)生次數(shù)（小鼠出現(xiàn)腹部肌肉反復(fù)收縮、拱背、臀部扭轉(zhuǎn)和后肢伸展）。

1.2.7 各草烏菌質(zhì)對(duì)昆明種小鼠抗炎作用 取健康昆明種雄性小鼠 60 只，體重 18～22 g，按體重隨機(jī)分為6 組，每組 10 只，分別為正常對(duì)照組、發(fā)酵空白組、草烏 + O①組、草烏 + A 組、草烏 + V組、草烏 + F 組，按生藥計(jì)給藥量均為6 g/kg。灌胃給藥，每日一次，連續(xù) 3 d。末次給藥后 1 h，在每只小鼠右耳均勻涂二甲苯 0.05 ml 致炎。30min后，小鼠脫頸椎處死，剪下耳廓，用 8mm 打孔器取雙側(cè)對(duì)稱處的耳片稱重，以兩片耳重量之差作為腫脹度。

圖1 部分真菌在草烏藥材上的生長(zhǎng)情況Figure 1 The growth of different fungi on crude drug

表2 10 種菌株在 PDA 培養(yǎng)基和烏頭基質(zhì)上第30 天生長(zhǎng)情況記錄Table 2 Growth of ten strains on nutrient and medicinal medium

表3 草烏菌質(zhì)得率情況Table 3 The yielding of fungi substance

圖2 草烏發(fā)酵前后 HPLC 圖譜Figure 2 HPLC chromatogram before and after fermentation

2 結(jié)果

2.1 菌絲體生長(zhǎng)情況及烏頭堿類的含量測(cè)定

在同一發(fā)酵條件下，槐耳、靈芝等 10 種真菌對(duì)以草烏生品為藥性基質(zhì)的發(fā)酵情況有所不同。根據(jù)真菌與基質(zhì)組合雙方的發(fā)酵情況，初步判定代號(hào)為A、D、E、F、H 等 10 種菌株與藥材“藥性基質(zhì)”基本相適應(yīng)，菌絲體能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育，部分真菌菌株在草烏基質(zhì)上的生長(zhǎng)情況，見圖1和表2。

2.2 草烏菌質(zhì)得率情況

在同一發(fā)酵條件下，槐耳、靈芝等 10 種真菌對(duì)以草烏生品為藥性基質(zhì)發(fā)酵情況有所不同，菌絲體生長(zhǎng)的好壞與發(fā)酵后藥性菌質(zhì)相對(duì)得率（%）呈負(fù)相關(guān)，即菌絲體生長(zhǎng)較好者，藥性菌質(zhì)相對(duì)得率（%）低；生長(zhǎng)較差者，菌質(zhì)相對(duì)得率（%）高。結(jié)果見表3。

2.3 草烏的指紋圖譜

草烏菌質(zhì)的生物堿類成分的指紋圖譜見圖2所示。與發(fā)酵空白比較，菌株 A、H、V等真菌作用于草烏后，指紋譜中顯示出有不同的新產(chǎn)生的或含量變化較大的未知成分。

2.4 草烏菌質(zhì)對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響

由表4可知，與發(fā)酵空白組比較，草烏 + A組、草烏 + V 組對(duì)抑制化學(xué)刺激所致的小鼠疼痛反應(yīng)有顯著性差異（P＜0.05）。

表4 草烏發(fā)酵前后對(duì)醋酸所致小鼠扭體次數(shù)的影響（±s，n = 10）Table 4 Effects of body twisting respond induced by acetic acid in mice (±s, n = 10)

表4 草烏發(fā)酵前后對(duì)醋酸所致小鼠扭體次數(shù)的影響（±s，n = 10）Table 4 Effects of body twisting respond induced by acetic acid in mice (±s, n = 10)

注：*P＜0.05 vs發(fā)酵空白組Note: *P＜0.05 vs control group

組別Groups劑量（g/kg）Dose (g/kg)扭體次數(shù)Writhing times發(fā)酵空白組Control group 6 34.00±10.21草烏 + O①Radix aconiti kusnezoffii+ O①6 27.20±8.35草烏 + A Radix aconiti kusnezoffii+A 6 24.80±4.13*草烏 + V Radix aconiti kusnezoffii+V 6 24.00±4.99*草烏 + F Radix aconiti kusnezoffii+F 6 28.80±12.88

2.5 草烏菌質(zhì)對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

由表5 可知，與發(fā)酵空白組比較，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)抑制化學(xué)刺激所致的炎癥反應(yīng)無差異。

表5 草烏發(fā)酵前后對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的抑制作用（±s ，n = 10）Table 5 Effects of mice ear edema induced by p-xylene (±s , n = 10)

表5 草烏發(fā)酵前后對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的抑制作用（±s ，n = 10）Table 5 Effects of mice ear edema induced by p-xylene (±s , n = 10)

組別Groups劑量（g/kg）Dose(g/kg)腫脹度（mg）Swelling degree(mg)發(fā)酵空白組Control group 6 13.90±6.21草烏 + O①Radix aconiti kusnezoffii+ O①6 18.70±8.54草烏 + A Radix aconiti kusnezoffii+A 6 16.00±7.48草烏 + V Radix aconiti kusnezoffii+V 6 16.78±3.70草烏 + F Radix aconiti kusnezoffii+F 6 13.70±6.27

3 討論

草烏藥材中烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿等雙酯型生物堿是其主要的毒性成分，也是這類藥材回陽救逆、溫中止痛的主要活性成分。

通過上述實(shí)驗(yàn)分析，藥用真菌雙向固體發(fā)酵草烏，與發(fā)酵空白組比較，草烏 + A 組、草烏 + V 組對(duì)抑制化學(xué)刺激所致的小鼠疼痛反應(yīng)有顯著性差異（P＜0.05）。

本項(xiàng)研究通過雙向固體發(fā)酵的方法為毒性強(qiáng)、療效好的烏頭類有毒中藥的解毒進(jìn)行了有益的嘗試，也為其他有毒中藥的解毒提供了一種新的途徑。

志謝對(duì)南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室方泰惠教授、喻斌老師在藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)方面的指導(dǎo)表示感謝。

[1]Zhuang Y.A new solid fermentation engineering (bidirectional)induced by medicinal fungus.Edible Fungi China, 2002, 21(4):3-6.(in Chinese)莊毅.藥用真菌新型(雙向型)固體發(fā)酵工程.中國(guó)食用菌, 2002,21(4):3-6.

[2]Pan Y, Zhang X, Jiang YP, et al.The content of strychnos alkaloids and to contrast the finger printing before and after two-way fermentation.J Nanjing Univ Chin Med, 2006, 22(6):362-365.(in Chinese)潘揚(yáng), 張弦, 蔣亞平, 等.雙向發(fā)酵前后馬錢子生物堿含量及其HPLC指紋譜的比較.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 22(6):362-365.