王麗非，朱元軍，王松梅，杜郁，余騰斐，王麗，洪斌

干擾素（interferon，IFN）是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)等活性的細胞因子，能通過多種機制影響腫瘤細胞功能，促進免疫細胞的活性[1]。干擾素是一個大的基因家族，可分為3 型，主要包括 IFNα、IFNβ 和 IFNγ[2]。IFNβ 主要用于病毒性疾病、惡性腫瘤和自身免疫性疾病的治療[3]。1993年，美國 FDA 批準了 Chiron 公司生產的IFNβ-1b 上市銷售，其商品名為Betaseron，用于治療多發(fā)性硬化癥、神經系統(tǒng)疾病。日本也批準了靜脈注射的 IFNβ 用于治療慢性乙型或丙型肝炎[4]。

盡管如干擾素、集落刺激因子等一些細胞因子已被開發(fā)成蛋白藥物用于臨床，但作為科研用試劑的細胞因子的開發(fā)在我國幾乎是一片空白，高價進口和受制于西方生物技術公司成為細胞因子來源的主要現(xiàn)狀。本工作在國家科技支撐計劃——“科研用細胞因子試劑平臺的完善和應用研究”的支持下，采用高效的宿主系統(tǒng)和載體表達標簽化細胞因子——組氨酸標簽人 β 干擾素（HIS-IFNβ），實現(xiàn)了可溶性表達，并利用 Ni sepharose 親和層析的方法，分離得到高純度的 HIS-IFNβ，并進行了生物學活性的檢測，為科研用標簽化細胞因子試劑的研制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 菌株、細胞株、病毒株和質粒 大腸桿菌E.coliTG1、E.coliBL21(DE3) 為本實驗室保存；人羊膜細胞（Wish細胞）購自中國科學院上海細胞中心；水泡性口膜炎病毒（VSV）為本研究所保存；質粒載體 pGEM-T 購自美國 Promega 公司；質粒載體 pET-16b 購自美國 Novogen 公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 大腸桿菌培養(yǎng)基 LB 的配制參見分子克隆操作指南[5]；氨芐青霉素在 LB 培養(yǎng)基中使用濃度為100 μg/ml；Wish 細胞所用 MEM 培養(yǎng)基購自美國 Thermo scientific 公司。

1.1.3 工具酶和生化試劑 限制性內切酶、T4 DNA 連接酶等均購自日本 TaKaRa 公司；PfuDNA 聚合酶購自上海生物工程公司。TA 克隆試劑盒，購自美國 Promega 公司；UNIQ-10 柱式 DNA膠回收試劑盒，購自上海生物工程公司。人 β 干擾素抗體和組氨酸標簽抗體購自美國 R&D 公司；人 β 干擾素標準品購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.4 儀器 miniCycleTMPTC-200 型 PCR 儀為美國 MJ Research 公司產品；SEMI-DRY TRANSFER 轉膜儀為美國 Bio-Rad 公司產品；?KTA Explorer 系統(tǒng)為美國 GE Healthcare 公司產品；SHIMADZU-20A 型高效液相色譜儀為日本島津公司產品；C8 反相柱 ZORBAX 300SB-C8為美國 Agilent 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 人 β 干擾素與組氨酸標簽融合蛋白重組表達菌株的構建 PCR 擴增、DNA 電泳及片段回收、大腸桿菌質粒提取和轉化、質粒酶切和連接等DNA 基本操作參見分子克隆操作指南[5]。提取人Bel-7402 細胞總 DNA 作為PCR 擴增的模板，設計一對引物（5’ TCCATATGATGAGCTACAACTTG CTTGG 3’ 和 5’ CGGGATCCTTAGTTTCGGAGGT AACCTGTAAG 3’），采用Pfu高保真 DNA 聚合酶進行 PCR 擴增。為確證 PCR 擴增得到的片段為正確的相關基因，將 PCR 產物電泳后進行膠回收純化，3’ 端加 A，克隆到 pGEM-T 載體上，得到重組質粒 pGEM-IFNβ。將重組質粒轉化至E.coliTG1 感受態(tài)細胞，挑取白斑，提取其中的重組質粒進行NdeI 和BamHI 雙酶切鑒定。鑒定正確后，瓊脂糖凝膠電泳回收NdeI 和BamHI 雙酶切片段和同樣經過上述酶切回收的載體 pET-16b 進行連接，轉化E.coliTG1，在含有 Amp 100 μg/ml的 LB 瓊脂平板上挑選轉化子。轉化子提質粒進行酶切鑒定，鑒定正確的重組表達質粒命名為pET16b-IFNβ。將重組表達質粒轉化E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細胞，獲得重組表達菌株E.coliBL21(DE3)/pET16b-IFNβ。

1.2.2 組氨酸標簽人 β 干擾素在大腸桿菌中表達條件的摸索 為了使重組蛋白在細胞裂解液上清中表達量最大化，本工作進一步優(yōu)化了重組菌株表達的 IPTG 誘導時間、濃度和溫度。將菌株E.coliBL21(DE3)/pET16b-IFNβ 接種于 5 ml LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，取 1 ml上述菌液，轉種50 ml LB 培養(yǎng)基 37℃培養(yǎng)，待菌液 OD600約為0.6～1.0 時，以不同濃度的 IPTG 誘導 8 h，取1 ml 菌液收集菌體，進行聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析。取上述 OD600約為0.6～1.0 時的菌液，在 0.08mmol/L IPTG 誘導條件下37℃分別培養(yǎng) 1、2、3、5、6、7、8 h，取 1 ml 菌液收集菌體，進行 SDS-PAGE 分析。取上述 OD600約為0.6～1.0 時的菌液，在 0.08mmol/L IPTG誘導條件下分別在 37℃和 28℃培養(yǎng) 6 h，取1 ml 菌液收集菌體，破碎細胞，分別取上清、沉淀進行 SDS-PAGE 分析。

1.2.3 Western blotting 分析 取菌株E.coliBL21(DE3)/pET16b-IFNβ 發(fā)酵液，收集菌體，破碎細胞，取上清進行 SDS-PAGE 后，取出凝膠放置于轉膜緩沖液中，用 Bio-Rad semi-dry transfer轉膜儀進行蛋白印跡轉移，根據(jù)凝膠面積按0.65 mA/cm2電轉移至 PVDF 膜。轉膜完畢后，將膜用麗春紅 S 溶液浸泡 5min，再用水漂洗脫色，以確認目標條帶是否成功轉移到 PVDF 膜上。然后將膜放入雜交袋，加入含 5%脫脂牛奶的 TBS，4℃封閉過夜。棄封閉液，加入用 5%脫脂牛奶稀釋（1∶1000）的一抗（人 β 干擾素抗體或抗His-tag 抗體），室溫緩慢振蕩 2 h。棄抗體，將膜以 TBS 漂洗 3 次，每次 5min，加入用 5%脫脂牛奶稀釋（1∶1000）的堿性磷酸酶標記的馬抗小鼠 IgG(H+L) 作為二抗，室溫緩慢振蕩 2 h。將膜放于 TBS 液中漂洗 3 次，每次 5min 后，膜置于堿性磷酸酶顯色底物 NBT/BCIP 溶液中，室溫顯色至特異性雜交條帶出現(xiàn)，將膜取出放置于去離子水中終止顯色。

1.2.4 組氨酸標簽人 β 干擾素純化 重組表達菌株在最適條件下進行培養(yǎng)，收集菌體，菌體用binding buffer 懸浮，置于冰浴中進行超聲破碎，直至無明顯菌體。10 000×g離心 10min，收集上清，0.45 μm 濾膜過濾備用。采用 ?KTA Explorer 系統(tǒng)，將過濾后的樣品上樣至以 5 倍體積 binding buffer（0.02 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，0.01 mol/L 咪唑，pH 8.0）平衡的 His Trap FF crude親和柱，以 elution buffer（0.02 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，0.25 mol/L 咪唑，pH 8.0）進行梯度洗脫，UV 280 nm 檢測收集目的蛋白峰。將含有目的蛋白的洗脫液合并，充分透析后冷凍干燥存儲。

1.2.5 高效液相分析重組蛋白純度 將純化的重組蛋白樣品進行 HPLC 分析，采用島津SHIMADZU-20A 儀器，C8 反相柱，流動相 A：20%乙腈，流動相 B：0.1%三氟乙酸（TFA），連續(xù)梯度洗脫，在 30min內乙腈濃度由 20%增至80%，流速為1 ml/min。記錄產物峰面積，并計算表達產物的純度。

1.2.6 人 β 干擾素生物學活性測定 參照 2005年版《中國藥典》第三部附錄中干擾素生物學活性測定法，依據(jù)細胞病變抑制法，將培養(yǎng)于含 10%小牛血清的 MEM 培養(yǎng)基中的 Wish 細胞生長24～48 h 時配成細胞濃度約為3×105個/ ml 的懸液，加到 96 孔細胞培養(yǎng)板上，每孔 100 μl。同時設立標準品對照。在含 5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng) 4～6 h 后，每孔加入 4 倍系列稀釋的干擾素樣品 100 μl，樣品稀釋用含 7%小牛血清的 MEM培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng) 18～24 h。棄上清后用含 3%小牛血清 MEM 培養(yǎng)基稀釋 VSV 至 100 TCID50進行攻擊，然后于含 5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)24 h 左右。棄掉培養(yǎng)板中的上清液，每孔加入 50 μl的結晶紫液室溫染色 30min，棄掉染液，用自來水沖洗殘余的染液，用濾紙吸干后每孔加入 100 μl的脫色液脫色，在 Bio-Rad 自動酶標儀上于570 nm 波長處測定每孔的吸收值（OD），記錄測定結果，將數(shù)據(jù)結果按照四參數(shù)回歸計算法進行處理，以標準品為參考，并根據(jù)下列公式計算待測樣品活性。

2 結果

2.1 人 β 干擾素與組氨酸標簽融合蛋白重組表達載體的構建及表達菌株的獲得

人 β 干擾素的編碼序列存在于一個外顯子上，提取人 Bel-7402 細胞總 DNA 作為PCR 擴增的模板進行擴增，得到預期大小的 PCR 產物（圖1A）。PCR 產物進行序列測定，測序結果與GenBank 數(shù)據(jù)庫進行 Blast 比對和分析，表明獲得的片段序列與已知人 β 干擾素的基因序列完全一致。本工作采用質粒 pET-16b 作為表達載體，將人 β 干擾素基因克隆至載體組氨酸標簽編碼序列之后，可表達組氨酸標簽與人 β 干擾素的融合蛋白。將人 β 干擾素基因片段克隆至載體 pET-16b，提取轉化子質粒進行酶切鑒定，獲得與 PCR 擴增的基因大小一致的片段（圖1B），表明人 β 干擾素基因成功插入了 pET-16b 質粒。將獲得的重組表達質粒命名為pET16b-IFNβ。將重組表達質粒轉化E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細胞，獲得重組表達菌株E.coliBL21(DE3)/pET16b-IFNβ。

圖1 IFNβ 的 PCR 擴增和 pET16b-IFNβ 的酶切驗證Figure 1 PCR product of IFNβ and restriction enzymatic analysis of pET16b-IFNβ

2.2 組氨酸標簽人 β 干擾素的表達

2.2.1 組氨酸標簽人 β 干擾素表達的 IPTG 誘導濃度、時間和溫度的摸索 以不同濃度的 IPTG誘導 8 h，SDS-PAGE 結果表明在 0.08mmol/L IPTG 誘導條件下表達量最高，增加 IPTG 誘導濃度表達量無明顯增加（圖2A）。在 0.08mmol/L IPTG 誘導條件下分別誘導不同時間，SDS-PAGE結果表明誘導 6 h 后，表達量已經達最大，以后沒有明顯增加（圖2B）。分別在 37℃和 28℃培養(yǎng)下進行誘導表達，SDS-PAGE 結果表明在 28℃培養(yǎng)下，表達產物存在于細胞裂解液上清中更多（圖2C）。最終確定最優(yōu)表達條件為，0.08mmol/L IPTG 誘導下，28℃培養(yǎng) 6 h。

2.2.2 Western blotting 檢測 表達的組氨酸標簽人 β 干擾素蛋白分子量約為20 kD，N-端帶有His-tag，分別用抗His-tag 抗體和人 β 干擾素特異性抗體進行 Western blotting 檢測。在約 20 kD 處有一明顯雜交條帶（圖3），表明該特異條帶為組氨酸標簽人 β 干擾素蛋白。

2.3 組氨酸標簽人 β 干擾素蛋白的純化

將組氨酸標簽人 β 干擾素表達菌株E.coliBL21(DE3)/pET16b-IFNβ 在最適條件下發(fā)酵，采用HisTrap FF crude 親和柱純化，收集目的蛋白，梯度透析，冷干。每升發(fā)酵液可獲得 28.2 mg 純化后的組氨酸標簽人 β 干擾素蛋白（圖4）。將純化的蛋白樣品進行 HPLC 分析，檢測其純度，結果顯示組氨酸標簽人 β 干擾素的保留時間為11.5min，純度為92%（圖5）。

圖2 HIS-IFNβ 在大腸桿菌 BL21(DE3) 中的表達Figure 2 The expression of HIS-IFNβ in E.coli BL21(DE3)

圖3 Western blotting檢測HIS-IFNβ的表達Figure 3 Western blotting analysis of the expression of HIS-IFNβ

圖4 HIS-IFNβ 蛋白的純化Figure 4 Purification of HIS-IFNβ

圖5 HPLC 檢測 HIS-IFNβ 的純度Figure 5 HPLC analysis of purified HIS-IFNβ

2.4 組氨酸標簽人 β 干擾素蛋白生物學活性測定

參照 2005年版《中國藥典》第三部附錄中干擾素生物學活性測定法，結果經干擾素 β 國家標準品（2008 國生標字 0015）校正，確定其比活性為4.2×107U/mg。

3 討論

作為科研用的細胞因子試劑，其應用領域主要為生命科學領域的遺傳學、發(fā)育學、細胞學、免疫學、生物化學和分子生物學，基礎醫(yī)學與藥學等，并包括了相應的應用性開發(fā)研究。為了增加科研用細胞因子試劑的示蹤性、可檢測性及其穩(wěn)定性，進一步完善、拓展科研用細胞因子試劑的特性，擴展其用途，使其逐步向高端產品方向邁進，我們進行了標簽化細胞因子（tag-細胞因子）試劑的研制，現(xiàn)已表達了多種標簽化的細胞因子。標簽化細胞因子不僅可方便細胞因子試劑本身的分離純化，利用此功能，還可方便地進一步分離和研究其受體或與其相互作用的分子，可提高基礎研究的效率和水平。同時，不僅其本身能作為普通的科研用細胞因子試劑，而且可作為研發(fā)臨床診斷試劑的重要的中間核心物質，具有潛在的診斷試劑特性。

本工作采用大腸桿菌表達系統(tǒng)中常用的E.coliBL21(DE3)，該宿主是以 T7 RNA 聚合酶為表達系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達宿主。載體 pET-16b在大腸桿菌中可以快速而有效地表達重組蛋白，它利用 T7 啟動子和終止子進行高效表達，并可在表達蛋白 N 端加上組氨酸標簽，便于表達產物的純化。而且在組氨酸標簽后加上凝血酶 Xa 的酶切位點，便于純化產物后將組氨酸標簽切除，利于產物的后續(xù)處理。本工作結果表明在此系統(tǒng)中可成功表達帶有組氨酸標簽的人 β 干擾素，每升發(fā)酵液可獲得 28.2 mg 純化后的組氨酸標簽人 β 干擾素蛋白。表達的融合蛋白既能與組氨酸標簽抗體產生結合反應，又可與人 β 干擾素抗體產生結合反應。利用 Ni sepharose 親和層析純化，從大腸桿菌的上清中分離得到純度 92%的細胞因子。干擾素生物學活性測定也表明，獲得的組氨酸標簽的人 β 干擾素具有人 β 干擾素生物學活性，比活性為4.2×107U/mg。本工作為進一步以此系統(tǒng)表達其他科研用標簽化的細胞因子奠定了基礎。

[1]Le Bon A, Tough DF.Links between innate and adaptive immunity via type I interferon.Curr Opin Immunol, 2002, 14(4):432-436.

[2]Liu XY.Interferon and its major breakthrough in Progress.China Prescription Drug, 2004(28):33-35.(in Chinese)劉新垣.干擾素研究及其重大突破性研究進展.中國處方藥,2004(28):33-35.

[3]Li NL, Ma AL, Yu QW, et al.Expression of human beta-IFN using yeast Pichia pastoris- fermentation strategy optimization.China Biotechnol, 2004, 24(1):57-61.(in Chinese)李寧麗, 馬安倫, 余奇溫, 等.酵母菌表達倍菲隆發(fā)酵工藝研究.中國生物工程雜志, 2004, 24(1):57-61.

[4]Zhang Q, Lei JY, Ding YD, et al.Expression and purification of IFNβ-HSA fusion protein in Pichia pastoris.Chin J Biotechnol, 2009,25(11):1746-1752.(in Chinese)張琦, 雷楗勇, 丁月娣, 等.人 β干擾素與人血清白蛋白融合蛋白的表達及純化.生物工程學報, 2009, 25(11):1746-1752.

[5]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T.Molecular cloning: a laboratory manual.2nd ed.New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999.