谷化平 尚培中

結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一。大量研究表明，結(jié)直腸癌的形成和轉(zhuǎn)移的發(fā)生是一個多基因、多因子共同作用的結(jié)果。我們采用免疫組化方法，探討表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelil growth factor,VEGF)和張力蛋白同源物基因(phoshatase and tension homology deleted on chromosome fen,PTEN)蛋白表達與結(jié)直腸癌浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，及EGFR、VEGF與 PTEN蛋白表達之間的相關(guān)性，為預(yù)測結(jié)直腸癌浸潤轉(zhuǎn)移提供客觀參考指標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 選取我院2004年～2010年手術(shù)切除的結(jié)直腸腺癌標本98例(結(jié)腸癌57例，直腸癌41例)，男性67例，女性31例，平均年齡(52.4±11.8)歲。取20例同期患者遠癌切緣處正常大腸黏膜組織(距癌灶>4cm)作為對照組。標本均經(jīng)40 g/L中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.1.2 試劑 鼠抗人EGFR、VEGF、PTEN抗體和LSAB試劑盒購自邁新生物技術(shù)公司(均為即用型)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 采用微波-鏈霉菌素-生物素(MW-LSAB)免疫組織化學法和應(yīng)用微波-金屬鹽抗原修復(fù)技術(shù)。即切片常規(guī)脫蠟水化后,放入枸櫞酸緩沖液(10 mmol/L，pH 6.0)內(nèi),用微波儀(YWY781A醫(yī)用型)170 W輻射5 min,冷卻后水洗。其他操作流程同常規(guī)LSAB法,所不同者為三步抗原孵育和正常血清封閉用微波儀130 W分別輻射5 min,保溫2 min即可。實驗用已知EGFR、VEGF和 PTEN表達陽性的胃癌組織作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。H2O2-DAB顯色。

1.2.2 結(jié)果判斷 EGFR以細胞質(zhì)和細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，VEGF以細胞質(zhì)、PTEN以細胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)陽性細胞比例分為4級：無陽性細胞為陰性(-);陽性細胞數(shù)<25%為弱陽性(+)，25%～75%為陽性(++)，>75%為強陽性(+++)；(+)以上為陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用χ2檢驗比較組間陽性率差異。

2 結(jié)果

2.1 EGFR、VEGF和 PTEN蛋白在結(jié)直腸癌和正常腸黏膜組織中的表達

EGFR、VEGF和 PTEN陽性產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色。EGFR陽性定位于細胞質(zhì)和細胞膜，結(jié)直腸癌組織中其陽性表達率為61.2%(60/98)，正常腸黏膜組織中未見陽性表達(0,0/20)，差異有顯著性(χ2=21.05,P<0.05)；VEGF陽性定位于細胞質(zhì)，結(jié)直腸癌組織中其陽性表達率為66.3%(65/98)，正常腸黏膜組織中陽性表達率為15.0%(3/20)，差異有顯著性(χ2=15.90,P<0.05)；PTEN陽性定位于細胞核(圖3)，結(jié)直腸癌組織中其陽性表達率為48.0%(47/98)，正常腸黏膜組織中其陽性表達率為100.0%(20/20)，差異有顯著性(χ2=14.72,P<0.05)。

2.2 EGFR、VEGF和 PTEN蛋白表達與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

EGFR、VEGF和PTEN蛋白陽性表達與結(jié)直腸癌腫瘤部位、大小、分化程度無關(guān)(P>0.05)，而與結(jié)直腸癌Dukes分期、漿膜浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 EGFR、VEGF和 PTEN蛋白表達與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 結(jié)直腸癌組織中EGFR、VEGF和 PTEN表達間的關(guān)系

EGFR表達陽性的60例結(jié)直腸癌組織中，VEGF和 PTEN陽性表達例數(shù)分別為47例(78.3%)和18例(30.0%)；EGFR陰性表達的38例結(jié)直腸癌組織中，VEGF和 PTEN陽性表達例數(shù)分別為19例(50.0%)和29例(76.3%)；EGFR陽性表達的結(jié)直腸癌組織中VEGF陽性表達率高于EGFR陰性表達的結(jié)直腸癌組織，差異有顯著性(χ2=8.36,P<0.05)，而PTEN陽性表達率低于EGFR陰性表達的結(jié)直腸癌組織，差異有顯著性(χ2=19.73,P<0.05)；VEGF陽性表達的65例結(jié)直腸癌組織中，PTEN陽性表達20例 (30.8%)；VEGF陰性表達33例中，PTEN陽性表達27例(81.8%)；VEGF表達陽性的結(jié)直腸癌組織中PTEN陽性表達率低于VEGF陰性表達的結(jié)直腸癌組織，差異有顯著性(χ2=22.85,P<0.05)。

3 討論

EGFR屬于酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族，其家族成員包括EGFR(HER1)、HER2、HER3、HER4 4種同源受體。EGFR廣泛表達于表皮細胞和基質(zhì)細胞、部分神經(jīng)膠質(zhì)細胞和平滑肌細胞，在調(diào)節(jié)細胞生長和組織修復(fù)中起著十分重要作用，其信號系統(tǒng)所引起的細胞效應(yīng)包括細胞增殖、遷移及黏附等多個環(huán)節(jié)。EGFR作為1種腫瘤標志具有許多有點，主要表現(xiàn)為EGFR基因在許多上皮來源的腫瘤組織中呈表達或過表達改變，EGFR的高表達可促進腫瘤細胞的增殖、血管生成、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤細胞的凋亡[1,2]。EGFR在頸部鱗癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、腎癌、卵巢癌及膀胱癌等上皮性腫瘤中均有表達及過表達，并與其腫瘤的臨床進展、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[3，4],它的失調(diào)與腫瘤對化療和放療的耐受以及不良預(yù)后相關(guān)，為腫瘤的治療提供了一個理想的分子靶點[5]。本研究結(jié)果顯示，在98例結(jié)直腸癌組織中EGFR表達陽性率為61.2%，顯著高于正常腸黏膜組織,并隨著Dukes分期增高、漿膜浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其表達水平亦隨著顯著性增高。提示，EGFR表達與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、生物學行為和臨床進展密切相關(guān)，高表達是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的標志。

VEGF是迄今所發(fā)現(xiàn)的最重要的促血管生成因子，它可通過血管內(nèi)皮上的受體(VEGFR)介導的受體信號轉(zhuǎn)導通路，促進血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移，阻止血管內(nèi)皮細胞凋亡和管腔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)退化，增加血管滲透性。VEGF在正常成人與動物組織中表達水平較低，但在胎兒及正在進行生理性血管生長的組織中表達水平較高。VEGF在腫瘤中表達水平較高，它可促使腫瘤血管生成，在維持腫瘤的持續(xù)生長中起著重要作用，同時也是腫瘤轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[6]，因此VEGF表達水平與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移情況、微血管密度等呈正相關(guān)，與患者的預(yù)后呈負相關(guān)。以VEGFR信號轉(zhuǎn)導通路為靶點進行腫瘤靶向治療已在多種腫瘤中取得了實質(zhì)性的療效。本研究結(jié)果顯示，在98例結(jié)直腸癌組織中VEGF表達陽性率為66.3%，顯著高于正常腸黏膜組織,并隨著Dukes分期增高、漿膜浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其表達水平亦隨著顯著性增高。提示，VEGF主要在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，臨床上檢測VEGF表達對預(yù)測腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能和指導治療方面具有較大實用價值，是1個預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要生物學參考指標。

PTEN是迄今發(fā)現(xiàn)的第1個具有磷酸酶活性的抑癌基因。通過結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，PTEN與細胞骨架蛋白和張力蛋白高度同源，提示PTNE可能參與細胞骨架重組并影響細胞遷移能力。當PTEN抑癌基因突變或缺失可能構(gòu)成1個新的信號轉(zhuǎn)導途徑，在調(diào)節(jié)細胞的增生和死亡、細胞的轉(zhuǎn)移和黏連等方面均起重要作用，與人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[7]。PTEN突變或缺失可以促進血管內(nèi)皮因子的形成，使血管內(nèi)皮細胞增殖和腫瘤微血管的形成，從而使腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力增高[8]。本研究結(jié)果顯示,PTEN蛋白表達陽性率在結(jié)直腸癌中顯著低于正常腸黏膜組織,并隨著Dukes分期增高、漿膜浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其表達水平亦隨著顯著性減低。提示，PTEN的丟失與結(jié)直腸癌的發(fā)生、細胞惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，在其腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中起著重要的抑制作用，可能是結(jié)直腸癌的發(fā)生和臨床進展過程中的晚期事件。在臨床病理活檢中，檢測其基因蛋白表達有助于深入了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并可作為早期診斷、預(yù)后判斷和評價腫瘤生物學行為的客觀指標，尤其對指導臨床采用基因治療提供依據(jù)及新思路更具有重要意義。

在惡性腫瘤發(fā)生的癌基因研究中，許多學者提出了基因協(xié)同作用假說，認為在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的各階段，至少有2個或2個以上功能不同的異常激活的基因各自發(fā)揮不同作用，并在時間和空間上相互配合，協(xié)同促進了細胞的癌變。有研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤的演進過程中，EGFR能通過增加VEGF表達或與其協(xié)同作用促進腫瘤內(nèi)新生血管形成，去除EGFR的作用會阻礙血管的進一步發(fā)生[9]，而PTEN可通過調(diào)節(jié)VEGF來抑制腫瘤細胞的運動性和血管形成[10]。本結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌中EGFR和VEGF表達呈正相關(guān)，兩者表達與PTEN表達呈負相關(guān)。表明在結(jié)直腸癌的系列病理過程中，EGFR、VEGF與PTEN具有相互協(xié)同效應(yīng)，其機理有待進一步深入探討。

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