宋 霞 程世紅 劉 純 劉亞麗 孫晶晶

肝細(xì)胞肝癌(hepatiocellular carcinoma，HCC，以下簡稱肝癌)是世界上也是我國最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)病56.4萬例，且有上升的趨勢(shì)[1]。近年來，環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)作為1個(gè)非常重要的腫瘤相關(guān)基因，得到了廣泛的重視。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)COX-2的基因多態(tài)性(SNP)與食管癌[2]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[3]、結(jié)腸癌[4]、乳腺癌[5]等腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，在肝癌組織中也發(fā)現(xiàn)了COX-2的異常表達(dá)[6]。本文對(duì)COX-2 啟動(dòng)子區(qū)域的-765 G/C基因多態(tài)性進(jìn)行分析，旨在探討COX-2 啟動(dòng)子區(qū)域-765G/C基因多態(tài)性與肝癌發(fā)生易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 資料

肝癌組300例，男性204例，女性96例，年齡42～74歲，平均59.13歲。健康對(duì)照組300例，男性192例，女性108例，年齡24～78歲，平均45.77歲。肝癌組選自2000年1月～2010年3月蘭州大學(xué)第一醫(yī)院普外二科、腫瘤科收治的、經(jīng)過血清學(xué)、臨床檢驗(yàn)、影像學(xué)、病理學(xué)檢查確診的患者，符合世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于肝癌的命名和診斷標(biāo)準(zhǔn)。健康對(duì)照組選自蘭州大學(xué)第一醫(yī)院體檢中心。同地區(qū)、排除病毒性肝炎、腫瘤和消化系統(tǒng)疾病的健康人群。兩組均為甘肅省常住人口(居住超過15年)，應(yīng)用統(tǒng)一調(diào)查表的形式進(jìn)行調(diào)查，包括年齡、性別、飲酒史和肝癌家族史，在納入研究前采集流行病學(xué)資料，每位患者均被告知研究細(xì)則，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 外周血基因組DNA的提取 清晨空腹采集外周靜脈血4 ml，k2-EDTA抗凝，-80℃凍存?zhèn)溆?。統(tǒng)一采用常規(guī)蛋白酶K、酚/氯仿法抽提外周血基因組DNA。

1.2.2 COX-2基因多態(tài)性檢測(cè) 采用多聚酶鏈反應(yīng)—限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)法，對(duì)COX-2-765G/C位點(diǎn)基因分型。引物參考文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)。上游引物：F 5’ -ATT CTG GCC ATC GCC GCT TC-3’；下游引物： R 5’ -CTC CTT GTT TCT TGG AAA GAG ACG-3’ (由上?；瞪镉邢薰竞铣?。反應(yīng)體系為50 μl，包括10×PCR buffer 5 μl，Mg2+3 μl，10 mmol/ L dNTPs 5 μl，引物1、2各2 μl，DNA模板1 μl，DNA聚合酶 1 μl，體積不足部分用雙蒸水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性3 min，95℃ 變性30 s，59℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，循環(huán)35次，最后72 ℃ 延伸10 min。用未加DNA模板的去離子水反應(yīng)體系作為陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物進(jìn)行Bsh 1236 I 限制性內(nèi)切酶酶切分型(Fermentas公司)，總反應(yīng)體系20 μl，包括PCR產(chǎn)物10 μl，10×PCR buffer R 2 μl，Bsh 1236 Ⅰ限制性內(nèi)切酶2 μl，其余部分用三蒸水補(bǔ)齊，37℃ 水浴14 h，3% 瓊脂糖凝膠(溴化乙錠染色)，100 V電泳40 min，電泳結(jié)束后用紫外反射透射分析儀對(duì)凝膠進(jìn)行觀察，照相。將PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物與DNA片段長度標(biāo)準(zhǔn)物(20 bp)比較以鑒定基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)樣本的群體代表性，用χ2檢驗(yàn)比較兩組基因型和等位基因頻率差異，以非條件Logistic 回歸計(jì)算相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)，評(píng)價(jià)各基因型與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，并以年齡、性別、飲酒史和家族史對(duì)等位基因頻率進(jìn)行分層分析。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)

COX-2 -765 G/C基因型分布在健康對(duì)照組符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)，具有群體代表性。

2.2 一般特性

肝癌組患者年齡42～74歲，中位年齡58歲；健康對(duì)照組年齡24～78歲，中位年齡51歲。兩組患者年齡、性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有飲酒史者肝癌組分布率高于健康對(duì)照組(66.3% vs 57.7%,P=0.029)。有肝癌家族史者肝癌組分布率高于健康對(duì)照組(16.3% vs 0.87%,P=0.005)，見表1。

表1 肝癌組與健康對(duì)照組的臨床特征(例，%)

2.3 COX-2 -765 G /C 多態(tài)性分析

COX-2 -765G/C 有G/G、G/C、和C/C 3種基因型。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為 157 bp，包含 Bsh 1236 I 酶切片段。G/G基因型(野生型) 的擴(kuò)增產(chǎn)物可被完全切斷，電泳可見134 bp 片段(23 bp 片段在瓊脂糖凝膠中不顯影)；G/C 基因型為雜合子，可見 157 bp 和134 bp 2種片段，C/C 基因型(突變純合子)不能被酶切斷，僅見157 bp 1種片段?；蚍中蛯?shí)驗(yàn)在雙盲狀態(tài)下進(jìn)行，采用單純隨機(jī)抽樣法，對(duì)5%的樣品進(jìn)行重復(fù)基因型檢測(cè)，獲得一致結(jié)果(圖 1) 。

圖1 COX-2 -765G /C 多態(tài)性PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果

M為Marker;1為PCR-RFLP擴(kuò)增產(chǎn)物;2為G/G基因型;3為G/C基因型;4為C/C基因型

2.4 COX-2 -765G/C在肝癌組與健康對(duì)照組的基因頻率及等位基因頻率分布比較

COX-2-765 G/C多態(tài)性位點(diǎn)3種基因型的分布率及與肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系見表2。與COX-2 -765G/G純合子相比，單獨(dú)攜帶COX-2 -765G/C或攜帶COX-2 -765C/C純合子基因型的個(gè)體在肝癌組和健康對(duì)照組的分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(G/C型：OR=2.119，95%CI：1.366～3.289；C/C型：OR=5.852，95%CI：1.269～26.990)。將COX-2 -765 G/C和C/C基因型合并后與COX-2 -765 G/G基因型進(jìn)行比較，肝癌組和健康對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(OR=1.311，95%CI：1.511～3.533)?？梢姡瑪y帶COX-2 -765*C基因型的個(gè)體比攜帶COX-2 -765G/G基因型的個(gè)體對(duì)肝癌更具有易感性，相同環(huán)境條件下，攜帶COX-2 -765*C基因型的個(gè)體患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。

2.5 COX-2 -765 G/C多態(tài)性與肝癌發(fā)生的相關(guān)性

依據(jù)年齡、性別、飲酒史和家族史幾個(gè)方面，對(duì)兩組COX-2 -765 G/C等位基因頻率進(jìn)行分層分析(表3)，并將G/C和C/C 2種基因型合并后與G/G基因型進(jìn)行比較。結(jié)果顯示：在年齡、性別的分層分析中，基因型在肝癌組和健康對(duì)照組的分布無差異。在飲酒史分層分析中，攜帶COX-2-765*C基因型的個(gè)體患原發(fā)性肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶COX-2-765G/G基因型的3.434倍(OR=3.434；95%CI：1.926～6.137)。在有肝癌家族史的人群中，攜帶COX-2-765*C基因型的個(gè)體患原發(fā)性肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶COX-2 -765G/G基因型的4.55倍(OR=4.550；95%CI：1.612～12.845)。

表2 COX-2-765 G/C基因型在肝癌組和對(duì)照組的分布情況(例，%)

表3 COX-2-765G/C基因型與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性的分層分析(例)

3 討論

環(huán)氧化合酶(cyclooxygenase,COX)是花生四烯酸合成前列腺素的關(guān)鍵限速酶，至少有2種同種異構(gòu)體，即COX-1和COX-2。COX-1是結(jié)構(gòu)酶，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在大多數(shù)組織細(xì)胞中恒長表達(dá)。COX-2是誘導(dǎo)酶，在正常生理狀態(tài)下的大多數(shù)組織中幾乎不表達(dá)，但是其可以被生長因子、細(xì)胞因子、血管作用多肽以及絲分裂素等誘導(dǎo)表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)COX-2基因多態(tài)性與胃癌[2]、乳腺癌[5]、結(jié)直腸癌[4]等的易感性相關(guān)。在肝癌組織中也發(fā)現(xiàn)了COX-2的異常表達(dá)[6]，COX-2在所有的肝癌組織中都表達(dá)，并且在高分化的肝癌組織中的表達(dá)高于低分化的肝癌組織，提示COX-2可能參與到了肝癌發(fā)生的早期事件中[8]。

本研究首次對(duì)COX-2 -765 G/C 基因多態(tài)性與肝癌易感性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：COX-2*C基因型的個(gè)體在肝癌組明顯高于健康對(duì)照組，提示COX-2 -765*C基因型的個(gè)體對(duì)肝癌更具有易感性，相同環(huán)境條件下，COX-2 -765*C基因型的個(gè)體患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。同時(shí)依據(jù)年齡、性別、飲酒史和家族史對(duì)COX-2 -765 G/C等位基因頻率進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)：有飲酒史或者家族史的COX-2-765*C基因型的個(gè)體對(duì)肝癌更具有易感性，提示COX-2-765*C基因型可能與飲酒史或者家族史具有協(xié)同的作用。然而，目前我們還不能解釋清楚COX-2-765*C基因型增加肝癌易感性的原因，可能是COX-2-765 G/C影響了COX-2的轉(zhuǎn)錄活性。COX-2的表達(dá)調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上，其中啟動(dòng)子及其活性對(duì)于轉(zhuǎn)錄的調(diào)控具有重要的作用。COX-2的5’端有TATA盒、CAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白反應(yīng)元件、CER(c AMP responsive element)反應(yīng)元件、AP-2(activator protein-2)結(jié)合位點(diǎn)，以及NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)[9]。當(dāng)細(xì)胞受到生長因子、脂多糖、癌基因(如ras、KRAS)等的刺激，經(jīng)過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用于COX-2 5’端的調(diào)控序列，促進(jìn)COX-2轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)。在腫瘤中，過度的表達(dá)COX-2會(huì)導(dǎo)致前列腺素(prostaglandin，PG)水平增高，PG可以通過促進(jìn)腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、刺激腫瘤細(xì)胞生長、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲力等多種機(jī)制誘發(fā)腫瘤的形成[8]。

但是，還有研究表明不同腫瘤類型中COX-2的表達(dá)不是完全相同的，在一些地域，一些腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，COX-2的過表達(dá)會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的生長[10]。Sitarz等對(duì)荷蘭人群研究發(fā)現(xiàn)與常見胃癌的COX-2過表達(dá)明顯不同，早期胃癌中COX-2低表達(dá)，并且在早期胃癌、常見胃癌以及殘胃癌中COX-2 -765*C 基因的頻率低于健康對(duì)照組[11]。Melchiorre Cervello等發(fā)現(xiàn)COX-2在所有的肝癌組織中都表達(dá)，并且在高分化肝癌組織中的表達(dá)高于低分化肝癌組織[8]。其可能的原因是等位基因隨著不同種族和地域而不同，或者是與選取的樣本數(shù)量有關(guān)。

在全世界范圍內(nèi)，我國屬于肝癌的高發(fā)國家之一。本研究發(fā)現(xiàn)COX-2 -765 G/C的C基因型增加肝癌易感性。然而，本研究僅僅是基于血清DNA水平的粗略研究，還有待于進(jìn)一步的深入和細(xì)化，同時(shí)值得注意的是，由于樣本量有限，本研究只能視為初步研究，有關(guān)的結(jié)論有必要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗(yàn)證。

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