金志良 孫新臣 徐炎華

高遷移率族蛋白組A1(high mobility group A1,HMGA1)可能是1種癌基因，它能促進細胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤細胞增殖和侵襲，抑制其凋亡。近年來，RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)的出現(xiàn)，為研究內(nèi)源性基因功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供了強有力的研究工具。本研究旨在構(gòu)建HMGA1siRNA慢病毒載體并轉(zhuǎn)染肺腺癌細胞SPCA-1，沉默HMGA1的表達，觀察其對細胞化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

慢病毒載體系統(tǒng)(上海吉凱基因公司)；吉西他濱(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)；RPMI1640(GIBCO公司)；HEPES(Amresco公司)；胎牛血清(天津TBD公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT,美國Siga公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基公司)；Trizol(美國Invitrogen公司)和TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(大連寶生物公司)；羊抗人HMGA1多抗(Santa Cruz 公司)，小鼠抗羊IgG(北京中杉公司)；人肺腺癌細胞株SPCA-1、慢病毒包裝細胞293T細胞株和大腸桿菌菌株DH5α(中科院上海細胞庫)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肺腺癌細胞株SPCA-1于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37℃下5%CO2水飽和培養(yǎng)箱中。細胞貼壁生長良好，每3天傳代1次。

1.3 人HMGA1基因shRNA模板序列的設(shè)計

前期實驗篩選出最有效的HMGA1-siRNA(siHMGA1)序列是:AAACCACCACAACTCCAGGAA。以此序列為模板，根據(jù)堿基互補配對原則設(shè)計寡核苷酸鏈，在互補兩條序列中間加入Loop,序列為TTCAAGAGA，使寡核苷酸可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),寡核苷酸序列兩端分別帶有酶切位點。正義鏈: 5′-TAAAC CACCA-CAACTCCAGGAATTCAAGAGATTCCTGGAGTTGTGGT-GGTTTTTTTTTC-3′；反義鏈:5′-TCGAGAAAAAAAAACCACCACAACTCCAGGA ATCTCTTGAATTCCTGGAGTTGTGGTGGTTTA-3′。陰性對照雙鏈寡核苷酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所形成的siRNA的作用序列為：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，此序列不與任何人類基因序列同源。

1.4 實驗方法

1.4.1 siHMGA1慢病毒表達載體的構(gòu)建 按照設(shè)計好的雙鏈DNA進行合成、退火，DNA稀釋到1 μg/μl，退火反應(yīng)體系如下：DNA模板單鏈正義鏈 5 μl，DNA模板單鏈反義鏈5 μl，5×Universal Buffer 20 μl，dd H2O 70 μl，總體積100 μl混勻，90℃溫育4 min，70℃溫育10 min，緩慢冷卻至室溫，稀釋至終濃度100 ng/μl。將退火產(chǎn)物與線性化處理的載體片段連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，將150 μl已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到含20 mmol/L MgSO4和Amp抗性的SOB瓊脂培養(yǎng)基上，將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平皿，于37℃培養(yǎng)16 h進行陽性克隆篩選。

1.4.2 PCR和DNA測序鑒定 挑取10個單菌落，使用載體多克隆位點兩端的引物進行PCR擴增，其中上游引物：5’- GCCCCGGTTAATTTGCATAT -3’；下游引物：5’- GTAATACGGTTATCCACGCG -3’。PCR體系如下：上下游引物各0.4 μl,MgCl20.5 μl，Taq polymerase 0.2 μl，DNTPs(2.5 mmol/L) 0.8 μl，ddH2O 14.7 μl,10×buffer 2.0 μl，Template 1 μl。 PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s(從第二步到第四步共30 cycle)，最后72℃延伸6 min。 PCR反應(yīng)結(jié)束后,取PCR產(chǎn)物5 μl上樣，進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。挑選陽性克隆,接菌,過夜培養(yǎng)后，應(yīng)用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，抽提好的質(zhì)粒應(yīng)用載體上的引物送測序(上海英俊公司完成)。

1.4.3 攜帶siHMGA1的慢病毒重組體的包裝 胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細胞，調(diào)整細胞密度為0.6×109/ L，接種于15 ml的細胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞密度達70%～80%時進行轉(zhuǎn)染。使用慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锖蜆?gòu)建好的慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞上清液，4℃、4 000 r/ min離心10 min除去細胞碎片，以0.45 μm濾器過濾上清液于40 ml超速離心管中。把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中并蓋上蓋子，將過濾杯插到含濾過液收集管中，4 000 r/ min離心約10～15 min，取出離心裝置，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開，過濾杯中的即為病毒濃縮液。將病毒濃縮液分裝到病毒保存管中，-70℃保存。

1.4.4 細胞轉(zhuǎn)染 胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的SPCA-1細胞，調(diào)整細胞密度為0.6×109/ L，接種于15 ml的細胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞密度達70%～80%時進行轉(zhuǎn)染。構(gòu)建好的HMGA1siRNA慢病毒質(zhì)粒和陰性siRNA慢病毒質(zhì)粒,按MOI值50轉(zhuǎn)染SPCA-1細胞，并分為陽性組、陰性組和空白組(未轉(zhuǎn)染的細胞)，轉(zhuǎn)染后4天，顯微鏡下觀察細胞生長良好。

1.4.5 RT-PCR檢測HMGA1mRNA表達 各組對數(shù)生長期的細胞用Trizol試劑盒(Invitrogen公司)抽提總RNA。RT-PCR步驟按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0說明書進行。HMGA1引物序列為5/-CTACTTTGCTTCCGCCACTC-3/，5/-GTGGCCCCTACACCCTTTAT-3/，擴增長度為419 bp；內(nèi)參β-actin引物序列為5/-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3/,5/-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3/,擴增長度為621 bp。以上引物均由上海生物工程公司合成。RT條件：42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。PCR條件：94℃ 2 min,94℃ 30 s,59℃ 30 s,72℃ 30 s，28個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳(100V,30 min)。Imagemaster VDS凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.4.6 Western印跡檢測HMGA1蛋白表達 用細胞裂解緩沖液裂解細胞，BCA 蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度。取2 0 μg蛋白經(jīng)1 0 %聚丙稀酰胺凝膠電泳，1 2 0V 恒定電壓轉(zhuǎn)膜2 h，室溫封閉1 h，4 ℃封閉過夜。HMGA1一抗工作濃度為1∶500，作用1 h; 二抗工作濃度1∶1 000，作用50 min，β-actin 一抗工作濃度為1∶600，二抗工作濃度為1∶1 000，抗體的反應(yīng)時間同HMGA1。然后按說明書滴加ECL發(fā)光液，反應(yīng)5 min 后，入暗室曝光10 min，顯影、照相。

1.4.7 MTT檢測細胞增殖情況 取陽性組和陰性組指數(shù)生長期細胞，以5 000個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)6個復(fù)孔，24 h后換為不同濃度吉西他濱(0.005 μg/ml、0.05 μg/ml、0.5 μg/ml、5 μg/ml、50 μg/ml)的培養(yǎng)液，并設(shè)空白對照組和陰性對照組。培養(yǎng)72 h后每孔加MTT 20 μl(5 mg/ml)再培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。置酶聯(lián)免疫檢測儀上，570 nm波長下，以空白孔調(diào)零，測定各孔光吸收值(A)。按下列公式計算細胞抑制率：

抑制率(%)=(1-給藥組平均A值/對照組平均A值)×100%

1.4.8 流式細胞術(shù)檢測 將陽性組和陰性組指數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)24 h后，換成含不同濃度吉西他濱(0.05 μg/ml、0.5 μg/ml、5 μg/ml)的培養(yǎng)液干預(yù)72 h后，收集約106個細胞，用PBS洗滌細胞2次。按試劑盒說明操作后應(yīng)用流式細胞儀檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 攜帶目的基因慢病毒質(zhì)粒的鑒定

2.1.1 PCR結(jié)果 PCR反應(yīng)結(jié)束后,取產(chǎn)物5 μl上樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，重組慢病毒載體的PCR產(chǎn)物是381 bp(插入片段59 bp)，經(jīng)雙酶切后沒有插入片段的pGCL-GFP空載體PCR產(chǎn)物是322 bp，鑒定結(jié)果與預(yù)期的相符，見圖1。

2.1.2 DNA測序鑒定 DNA測序的結(jié)果與實驗要求的DNA序列完全一致(圖2)。對于測序結(jié)果正確的克隆，進行不含內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取，提取完成之后，用蛋白核酸測定儀(Eppendorf,PS232C) 測量Lentivector-siHMGA1 plasmid DNA，D260/D280 值為1.9，表明獲得了純度和完整性均較高的質(zhì)粒DNA。

圖1 慢病毒質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳圖

1為空白對照 (ddH2O)，2為DNA 標(biāo)記，3為陰性對照(空載體322 bp)，4～8為HMGA1慢病毒質(zhì)粒(381 bp)

圖2 慢病毒質(zhì)粒DNA測序結(jié)果

2.2 RNAi下調(diào)SPCA-1細胞HMGA1mRNA表達水平

半定量RT-PCR結(jié)果，以瓊脂糖凝膠電泳條帶的亮度來判斷HMGA1的mRNA表達高低，結(jié)果顯示陽性組HMGA1mRNA的表達量明顯低于陰性組和空白組(后兩組間無差異，P>0.05)，說明干擾的效率很高(圖3)。

圖3 RT-PCR檢測結(jié)果

1為DNA標(biāo)記，2為陽性組，3為陰性組，4為空白組

2.3 RNAi下調(diào)SPCA-1細胞HMGA1蛋白表達水平

Western blot結(jié)果以蛋白條帶的亮度來判斷HMGA1的蛋白表達高低，結(jié)果顯示陽性組HMGA1 mRNA的表達量明顯低于陰性組和空白組，說明干擾的效率很高(圖4)。

圖4 Western blot檢測結(jié)果

1為陽性組，2為陰性組，3為空白組

2.4 吉西他濱對陽性組、陰性組細胞的體外增殖抑制效應(yīng)

分別以0.005 μg/ml、0.05 μg/ml、0.5 μg/ml、5 μg/ml、50 μg/ml吉西他濱處理各組細胞72 h后，陽性組較陰性組抑制率明顯升高 (圖5)。根據(jù)MTT吸光值計算IC50值，陽性組為(0.309±0.003)μg/ml，陰性組為(0.653±0.003)μg/ml，兩組比較具有差異性(P<0.05)。

2.5 吉西他濱對陽性組和陰性組細胞凋亡率的影響

細胞經(jīng)0.05 μg/ml、0.5 μg/ml和0.5 μg/ml吉西他濱處理72 h后，陽性組凋亡率分別為(9.53±0.42)%、(16.67±0.45)%和(25.40±0.79)%，陰性組凋亡率分別為(7.43±0.21)%、(11.00±0.20)%和(14.93±0.31)%，差異具有顯著性﹙P<0.05﹚，見圖6。

圖5 不同濃度吉西他濱作用下2組細胞生長抑制曲線和IC50值

圖6 不同濃度吉西他濱作用下2組細胞凋亡率情況

A～C為陽性組；A1～C1為陰性組

3 討論

慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制(posttranscriptional gene silencing,PFGS)。dsRNA經(jīng)RNA沉默復(fù)合體(RNA-induced silencingcomplex,RISC)降解成21-23nt的小干擾RNA(short Interference RNA，siRNA)，并以其為模板，特定位點和特定間隔地降解與之序列互補的mRNA。RNAi具有快速、有效、容易操作和序列特異性強等優(yōu)點。近年來的研究表明以慢病毒為載體可以明顯增加RNA干擾的轉(zhuǎn)染和干擾效率[1]。因此，本實驗選擇慢病毒為載體。本實驗結(jié)果表明，通過慢病毒轉(zhuǎn)染HMGA1基因的干擾序列到肺癌細胞后，無論是在RNA水平和蛋白水平目的基因幾乎不表達，說明該種方法效率高、可操作性強。成功的下調(diào)肺癌細胞中HMGA1基因的表達為我們后面的實驗奠定了基礎(chǔ)。

人的HMGA1基因是高遷移率族蛋白HMG(high mobility group protein)中的一員，又稱為HMGI(Y)基因，位于染色體的6p21。研究表明正常成年個體組織中HMGI(Y) 基因很少表達甚至不表達,然而在胚胎的發(fā)育過程中和惡性腫瘤中的表達水平卻很高，而且一般來說，HMGI (Y) 基因表達水平的高低與腫瘤的惡性程度有關(guān)[2]。這與它的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)，它最顯著的特點是擁有3個相似但又相互獨立的特殊結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能和DNA中富含A-T序列的小溝結(jié)合，稱為A-T溝序列，它含有3個堿性八肽的DNA結(jié)合模體，該模體的核心結(jié)構(gòu)是BBXRGRXB,B(G或R)代表堿性氨基酸,X是甘氨酸或脯氨酸[3]。這類蛋白質(zhì)通過A-T溝序列優(yōu)先與DNA小溝中富含AT的序列結(jié)合，誘導(dǎo)增強子所調(diào)控的啟動子發(fā)生結(jié)構(gòu)特異性的變化，使相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子在同一識別位點與大溝發(fā)生相互作用，或者直接與HMGI(Y) 蛋白發(fā)生作用，從而進一步增強轉(zhuǎn)錄，調(diào)控腫瘤相關(guān)基因表達和細胞分化[4,5]。從而使正常細胞惡變和轉(zhuǎn)化，腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。本實驗RT-PCR和Western blot證明該基因在肺癌細胞中的表達也很高，表明HMGA1基因可能對肺癌細胞生長、分化和惡變起到調(diào)控作用，有可能是肺腺癌細胞發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子之一。

當(dāng)通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)肺癌細胞中的HMGA1基因表達后，在吉西他濱的干預(yù)下陽性組生長抑制率明顯高于陰性組進一步說明：一方面該基因可能調(diào)控肺癌細胞分化、生長和增殖以及腫瘤細胞相關(guān)基因表達,當(dāng)它表達下調(diào)后,吉西他濱抑制陽性組細胞生長的能力相對增強；另一方面說明該基因是影響肺癌細胞化療敏感性的重要基因之一。后者與近年來文獻的報道是一致的[6]。研究還發(fā)現(xiàn)在相同濃度吉西他濱的作用下，低表達HMGA1的陽性組比高表達HMGA1陰性組凋亡率要高，表明HMGA1基因表達下調(diào)后藥物敏感性的改變可能是和細胞凋亡機制有關(guān)。近年來，研究表明HMGA1具有抗凋亡的作用，其具體抑制凋亡的機制還不是很清楚，可能是通過作用于凋亡基因p53的活化劑HIPK2，阻止它進入細胞核，抑制它的活化，從而抑制p53基因的功能，阻止細胞凋亡[7,8]；也可能是通過激活磷脂酰肌醇3激酶和(或)蛋白激酶B信號途徑(PI3K/Akt)中的Akt，后者進一步抑制凋亡蛋白酶Caspase-3和Caspase-9的活性，從而抑制細胞凋亡[6]。另外，吉西他濱抗腫瘤作用之一就是誘導(dǎo)細胞凋亡。所以，當(dāng)肺癌細胞中的HMGA1表達下調(diào)后，其抗凋亡作用減弱，吉西他濱誘導(dǎo)陽性組細胞凋亡的比例增加。

綜上所述，HMGA1基因表達下調(diào)后能夠增加肺癌細胞對吉西他濱的敏感性，其機制可能和抑制其抗凋亡作用有關(guān)，具體的信號途徑還不是很清楚，有待進一步研究。

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