張英,黃俊濤,段軼軒,湯園園

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不同時(shí)間電針對(duì)急性腦出血大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

張英1,黃俊濤2,段軼軒3,湯園園4

(1.江漢大學(xué),武漢 430056;2.宜昌市葛洲壩中心醫(yī)院,湖北 443002;3.武漢市武昌區(qū)惠民醫(yī)院,湖北 430060; 4.湖北中醫(yī)藥大學(xué)2009級(jí)碩士生,武漢 430060)

觀察不同時(shí)間點(diǎn)針刺治療對(duì)急性腦出血大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為7組,正常組、模型組(模型1組、模型2組、模型3組、模型4組)、3 h電針組和72 h電針組,采用膠原酶Ⅶ誘發(fā)大鼠尾殼核腦出血模型。3 h電針組和72 h電針組分別于造模后3 h、72 h時(shí)開始針刺,每日1次,共針刺5次。檢測(cè)血紅素氧合酶-1(Heme Oxygenase-1,HO-1)和血紅素氧合酶-2(Heme Oxygenase-2,HO-2)。造模后腦組織內(nèi)見大量腦出血,神經(jīng)纖維纏結(jié)、斷裂;3 h電針組腦組織仍可見泡沫細(xì)胞浸潤及出血;72 h電針組腦組織內(nèi)壞死灶明顯縮小、小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤、極少量出血。正常大鼠腦組織均有HO-1和HO-2表達(dá),腦出血大鼠HO-1表達(dá)明顯增高,并與時(shí)間變化有一定聯(lián)系。3 h電針組、72 h電針組HO-1均降低,兩組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。造模后5 d大鼠腦組織內(nèi)未出現(xiàn)HO-2表達(dá),造模后8 d出現(xiàn)表達(dá),3 h電針組、72 h電針組均出現(xiàn)HO-2表達(dá),72 h電針組較3 h電針組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。電針可以改善急性腦出血后腦組織出血狀況,降低腦出血后氧化應(yīng)激反應(yīng),對(duì)急性腦出血后神經(jīng)元損傷有一定的修復(fù)作用。腦出血后72 h電針比3 h電針療效好,提示急性期腦出血早期應(yīng)該慎重選擇電針治療。

腦出血;電針;氧化應(yīng)激;大鼠

腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是嚴(yán)重危害人類生命和健康的疾病,是中老年人致殘和死亡的主要原因之一。腦出血后損傷組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)在腦水腫的發(fā)生和神經(jīng)元損傷過程中起重要作用,與患者急性期的存活和后期的康復(fù)效果關(guān)系密切[1]。針灸治療腦出血的臨床和實(shí)驗(yàn)研究很多[2,3],但是關(guān)于針灸治療腦出血的時(shí)機(jī)仍然存在著較大的爭(zhēng)議。由此我們以膠原酶Ⅶ誘導(dǎo)大鼠尾殼核腦出血為模型,從氧化應(yīng)激反應(yīng)角度,研究不同時(shí)間點(diǎn)電針對(duì)腦組織HO-1和HO-2表達(dá)的影響,以期為臨床針刺治療腦出血提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Wistar雄性大鼠56只,體重在200～250 g,由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)用品

主要實(shí)驗(yàn)器械用腦立體定位儀SR-6N型(日本產(chǎn))、腦立體定位鉆SD-101型(日本產(chǎn))、G6805-2型針灸治療儀(中國上海)。

主要實(shí)驗(yàn)試劑為膠原酶Ⅶ(1500 U,由南京建成生物試劑有限公司提供);HO-1、HO-2免疫組化染色試劑盒,DAB顯色試劑盒,0.01 mol/L PBS(pH7.2～7.6)(由武漢博士德生物試劑有限公司提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組

將大鼠按體重編號(hào),隨機(jī)分為7組,正常組、模型組(模型組分為模型1組、模型2組、模型3組、模型4組)、3 h電針組和72 h電針組,每組8只。造模后死亡3只,立即進(jìn)行補(bǔ)充,所用動(dòng)物均在江漢大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

1.2.2 造模方法

采用膠原酶Ⅶ誘發(fā)大鼠尾殼核腦出血模型[4]。動(dòng)物經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉(400 mg/kg)后固定于腦立體定位儀上,以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn),向后1 mm,矢狀縫向右4 mm,確定注射點(diǎn)坐標(biāo),用腦立體定位鉆(直徑1.0 mm)在注射點(diǎn)鉆透顱骨,用1mL的微量注射器吸取0.5mL的膠原酶溶液(1 U/mL)注入,鉆孔處填入醫(yī)用無菌棉球止血。腹腔注射氨芐青霉素8萬U,動(dòng)物清醒后放回籠內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2.3 處理方法

①正常組不進(jìn)行任何處理。②模型組造模同上。③模型1組和模型2組分別于造模后3 h、72 h時(shí)處死,灌注取樣本;分別作為3 h電針組、72 h電針組治療前對(duì)照;模型3組和模型4組分別在造模后3 h＋5 d、72 h＋5 d處死,灌注取樣本。分別作為3 h電針組、72 h電針組治療后對(duì)照。④電針組造模同上。

針刺用0.30 mm×15 mm毫針針刺水溝、內(nèi)關(guān)(雙側(cè))、三陰交(雙側(cè))。取穴標(biāo)準(zhǔn)及針刺深度參照《常用動(dòng)物腧穴圖譜》[5]標(biāo)準(zhǔn)而定。接G6805-2型針灸治療儀,選連續(xù)波,頻率2 Hz,強(qiáng)度1 mA,留針30 min。

3 h電針組和72 h電針組分別于造模后3 h、72 h時(shí)即刻針刺1次,此后4天,每日1次,針刺5次后處死取材。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法

各組大鼠均用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,開胸經(jīng)升主動(dòng)脈依次灌入生理鹽水100 mL、4℃預(yù)冷的含4%多聚甲醛的0.01 mol/L磷酸緩沖液(PBS,pH7.4) 400 mL。灌畢取腦,置于4%多聚甲醛溶液過夜后固定。以注射點(diǎn)為中心冠狀石蠟切片,片厚5mm,連續(xù)切10片,貼于APES防脫片膠處理的載玻片備染。

1.2.4.1 HE染色

石蠟切片,常規(guī)脫蠟水化,蘇木精5 min,水洗,鹽酸乙醇分化20 s,充分水洗,弱氨水返蘭20 s,充分水洗并浸泡10 min,伊紅染色20 min,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.2.4.2 腦組織HO-1、HO-2測(cè)定

采用免疫組化ABC法。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,運(yùn)用SPSS14.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用單因素方差分析(one-way ANOVA),多個(gè)樣本均數(shù)之間的兩兩比較采用檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織HE染色比較

正常腦組織未見明顯異常改變;模型1組腦組織內(nèi)見大量腦出血,神經(jīng)纖維纏結(jié)、斷裂,腦組織內(nèi)未見明顯小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤;模型2組腦組織內(nèi)見少量出血,少許小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤及大量液化性壞死;模型3組腦組織內(nèi)可見大量小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤、壞死伴少量出血;模型4組腦組織內(nèi)可見液化灶縮小及大量小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤; 3 h電針組腦組織內(nèi)可見泡沫細(xì)胞浸潤及出血;72 h電針組腦組織內(nèi)可見壞死灶明顯縮小、小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤、極少量出血。

2.2 各組腦組織HO-1表達(dá)的比較

正常組大鼠腦組織有HO-1表達(dá),4個(gè)模型組腦組織HO-1表達(dá)較正常組均升高(＜0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并隨著時(shí)間延長而增高,造模5 d后達(dá)到高峰,造模后8 d稍有下降;3 h電針組較模型1組HO-1表達(dá)增高(＜0.01),較模型3組表達(dá)降低(＜0.01); 72 h電針組HO-1表達(dá)較模型2組明顯增高,有顯著性差異(＜0.01),較模型4組表達(dá)降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05);72 h電針組較3 h電針組稍高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。詳見表1。

2.3 各組腦組織HO-2表達(dá)的比較

正常組大鼠腦組織有HO-2表達(dá),模型1組、模型2組、模型3組均未見HO-2表達(dá),模型4組出現(xiàn)HO-2表達(dá),與正常組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05); 3 h電針組出現(xiàn)HO-2表達(dá),但較正常組表達(dá)低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);72電針組HO-2表達(dá)與正常組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05),與模型4組比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05),較3 h電針組增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。詳見表1。

表1 各組腦組織HO-1、HO-2表達(dá)的比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.05,2)＜0.01;與模型1組比較3)＜0.01;與模型2組比較4)＜0.01;與模型3組比較5)＜0.01;與模型4組比較6)＜0.05;與3 h電針組比較7)＜0.05

3 討論

3.1 急性腦出血與氧化應(yīng)激反應(yīng)

腦出血后由于缺血、缺氧產(chǎn)生大量的氧自由基,破壞機(jī)體正常的氧化/還原的動(dòng)態(tài)平衡,造成生物大分子(核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì))的氧化損傷,形成嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HO系統(tǒng)作為含鐵血紅素代謝的限速酶參與了氧化應(yīng)激反應(yīng),HO-1主要在應(yīng)激狀態(tài)下保護(hù)細(xì)胞和組織,對(duì)抗應(yīng)激反應(yīng);HO-2則主要在正常生理狀態(tài)下發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用更為重要。腦出血大鼠HO-1蛋白表達(dá)在出血后12 h到2 d逐漸增強(qiáng),到2 d時(shí)達(dá)到高峰,后期的下降則與heme大量降解有關(guān)。正常情況下大鼠前腦、中腦、基底節(jié)、丘腦區(qū)、小腦和腦干等神經(jīng)元均有強(qiáng)而穩(wěn)定的HO-2表達(dá)。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,HO-1、HO-2均在正常腦組織中出現(xiàn)陽性表達(dá),急性腦出血后大鼠血腫周圍腦組織HO-1表達(dá)增高,出血3 h后表達(dá)增加,72 h達(dá)高峰,持續(xù)1星期仍有表達(dá),HO-2在出血后3 h至5 d時(shí)均無表達(dá),而在8 d出現(xiàn)表達(dá)。說明氧化應(yīng)激反應(yīng)可能參與了腦出血后的腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞的損害,并與發(fā)病時(shí)間密切相關(guān),這與其他研究者的研究結(jié)果基本一致[6-9]。

3.2 中醫(yī)對(duì)腦出血的認(rèn)識(shí)

急性“腦出血”與中風(fēng)一病相近,陽亢風(fēng)動(dòng),氣升血逆為本病的病因病機(jī)。本研究參照醒腦開竅法[10]選用內(nèi)關(guān)、水溝、三陰交為主穴,內(nèi)關(guān)、水溝開竅醒神通絡(luò),三陰交生髓醒腦,滋水熄風(fēng),補(bǔ)瀉兼施,可收標(biāo)本兼顧之效。

3.3 不同時(shí)間電針對(duì)急性腦出血后氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

電針對(duì)急性腦出血后氧化應(yīng)激反應(yīng)具有一定的影響,并因介入的時(shí)間不同而出現(xiàn)作用差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,3 h電針組療效不及72 h電針組。腦出血后3 h開始電針治療的大鼠,腦組織仍有大量出血和炎癥反應(yīng),HO-1的表達(dá)較治療前下降,HO-2表達(dá)均較治療前增高;腦出血后72 h電針治療的大鼠腦組織壞死病灶較治療前明顯縮小,HO-1表達(dá)較治療前降低,HO-2表達(dá)較治療前增高,說明電針可能通過降低腦出血后腦組織HO-1表達(dá),提高HO-2表達(dá),通過催化血紅素生成CO、鐵、膽紅素,發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)微循環(huán)的作用,從而對(duì)腦出血后腦水腫及神經(jīng)元的修復(fù)產(chǎn)生一定的影響,但不同時(shí)機(jī)進(jìn)行針刺治療存在療效差異,提示臨床治療腦出血應(yīng)注意針刺時(shí)機(jī)的選擇。

所以出現(xiàn)以上結(jié)果,可能與以下因素有關(guān)。①急性腦出血極早期采用電針治療,可能形成了較強(qiáng)的刺激,有加重腦出血可能;②腦出血后1星期內(nèi),氧化應(yīng)激反應(yīng)處于上升階段,可能影響電針治療效果評(píng)價(jià);③動(dòng)物的自我修復(fù)能力較強(qiáng)。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),未接受針刺治療,即造模后自然存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束大鼠與72 h電針組大鼠相比,腦組織出血、HO-1表達(dá)無明顯差異,HO-2表達(dá)尚高于72 h電針組,可能與大鼠急性腦出血后的自我修復(fù)有關(guān)。

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Effects of Electroacupuncture at Different Times on Oxidative Stress Reaction in Rats with Acute Cerebral Hemorrhage

1,-2,-3,-4.

1.,430056,; 2.,,443002,; 3.,430060,; 4.’2009,,430060,

To investigate the effects of electroacupuncture at different time points on oxidative stress reaction in rats with acute cerebral hemorrhage.Wistar rats were randomly allocated to seven groups: normal, model (1, 2, 3 and 4), 3 h electroacupuncture and 72 h electroacupuncture. A rat model of caudate and putaminal hemorrhage was made using collagenase Ⅶ. The 3 h and 72 h electroacupuncture groups were acupunctured at 3 hrs and 72 hrs after model making, respectively. Acupuncture was given once daily, for 5 times. Heme oxygenase-1 (OH-1) and heme oxygenase-2 (OH-2) were measured.Cerebral hemorrhage, and neurofibrillary tangles and disruption appeared after model making. Cerebral foam cell infiltration and bleeding was still visible in the 3 h electroacupuncture group. The necrotic foci became small obviously and microglia infiltration and very small amounts of blooding existed in the brain tissue in the 72 h electroacupuncture group. Cerebral OH-1 and OH-2 were both expressed in the normal rats. The OH-1 expression increased significantly and was related to the time change in the cerebral hemorrhage rats. The OH-1 expression decreased in both 3 h and 72 h electroacupuncture groups, but there was no statistically significant difference between the two groups (＞0.05). Rat cerebral OH-2 expression did not appear at 5 days after model making but did at 8 days. The OH-2 expression appeared in both 3 h and 72 h electroacupuncture groups and was higher in the 72 h electroacupuncture group than in the 3 h electroacupuncture group. The difference was statistically significant (＜0.05).Electroacupuncture can reduce brain tissue bleeding and oxidative stress reaction and has a certain repairing effect on injured neurons after acute cerebral hemorrhage. The therapeutic effect of electroacupuncture at 72 hrs after cerebral hemorrhage is better than that at 3 hrs, suggesting that electroacupuncture treatment should be cautiously selected in the early stage of acute cerebral hemorrhage.

Cerebral hemorrhage; Electroacupuncture; Oxidative stress reaction; Rat

1005-0957(2011)06-0418-03

R2-03

10.3969/j.issn.1005-0957.2011.06.418

2010-12-20

張英(1968 - ),女,副教授,博士

A