李桂平，石 磊，杜元灝，李 穎

腦梗死即神經(jīng)元、膠質(zhì)和血管的死亡。在大腦組織中，神經(jīng)元對缺血的耐受性最差，由于大腦幾乎無能量儲備，因而需要持續(xù)而充足的血液供應(yīng)來維持功能，當血液或氧供應(yīng)停止后，神經(jīng)元在數(shù)分鐘內(nèi)即發(fā)生不可逆損傷[1]。由缺血、缺氧或低血糖等不同病因引起的腦梗死，雖然易損區(qū)和組織病理學表現(xiàn)各異，但其最終引起缺血中心部分的細胞由于缺氧而死亡，缺血半暗帶的細胞由于繼發(fā)的代謝改變而損傷。

腦梗死急性發(fā)生后，腦表面?zhèn)戎а芟到y(tǒng)猶如一個“閘門”，決定著腦缺血區(qū)能否及時有效地接受來自缺血周邊區(qū)的側(cè)支循環(huán)血流，并壓送這些代償血流進入微細血管，以營養(yǎng)缺血的神經(jīng)元組織，“閘門”的機能狀態(tài)決定著缺血細胞的命運。急性腦梗死發(fā)生后，造成“閘門”的阻力增大，開放不利，微血管自律運動出現(xiàn)高頻率低振幅，其流質(zhì)、流場的動態(tài)耦合發(fā)生障礙，表現(xiàn)為“高速低效震蕩”，成為缺血腦組織獲取代償血流的障礙，因此，腦梗死發(fā)生后，如何迅速而有效的重建微血管側(cè)支循環(huán)，恢復(fù)缺血區(qū)及半暗帶的血流供應(yīng)，成為治療的關(guān)鍵。

本研究基于上述理論進行設(shè)計，擬達到以下目的：1）以凝集素組織化學技術(shù)顯示微血管整體形態(tài)，建立可靠的實驗方法。2）直觀反映腦梗死后微血管的形態(tài)學變化以及針刺的干預(yù)效果，從血管量上反映側(cè)支循環(huán)建立情況。3）根據(jù)腦梗死后電針干預(yù)效果，為針刺干預(yù)時機的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性Wistar大鼠（由中國醫(yī)學科學院實驗動物養(yǎng)殖中心提供），體質(zhì)量180~200 g，隨機分為模型對照組、電針干預(yù)組和空白對照組。模型對照組、電針干預(yù)組又分為1、3、6 h 3個時相組。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 主要儀器 LH202H型韓氏電針儀（中國北京）；Leica CM9100冰凍切片機；恒溫孵育箱；微量進樣器。

1.2.2 主要試劑 蕃茄凝集素（Lycopersicon esculentum agglutinin，Vector公司，產(chǎn)品編號：B-1175）；ABC 染色試劑盒(VECTORSTAIN ABC kit，Vector公司，北京中杉金橋生物有限公司分裝，產(chǎn)品編號：PK-4002）；濃縮型二氨基聯(lián)苯胺染色（DAB）試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司，產(chǎn)品編號：ZLI-9032）；0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

2 實驗步驟

2.1 模型復(fù)制 采用Longa的腔內(nèi)線栓法阻滯大鼠左側(cè)大腦中動脈，復(fù)制腦梗死模型，尼龍線直徑為0.205 mm。大鼠經(jīng)10%水合氯醛（0.003 mL/g）腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥于手術(shù)臺上，頸正中偏左側(cè)切口，分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈，頸總動脈近心端和分叉處放置動脈夾，在兩動脈夾中間扎孔，插入尼龍線拴，長度18~22mm，線栓進入頸內(nèi)動脈稍遇阻力即停止進線，結(jié)扎線拴和頸總動脈，放開頸總動脈近心端動脈夾，縫合皮膚。

2.2 模型納入、排除標準 參照Longa 5分制評分標準，0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺失（不能完全伸展右側(cè)前肢，左側(cè)Horner’s征陽性）；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺失（提尾懸空時右前肢屈曲、內(nèi)收，行走時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈）；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺失（站立不穩(wěn)，向右側(cè)傾倒）；4分：不能自發(fā)行走，意識水平降低。

評分在1～3分為造模成功，以下兩種情況為模型復(fù)制不成功，予以剔除：1）實驗過程中大鼠死亡。2）在規(guī)定時間處死動物，取腦時見有蛛網(wǎng)膜下腔出血或頸內(nèi)動脈分叉部出血。

2.3 處理方法 電針干預(yù)組在大腦中動脈梗死（MCAO）后即刻電針刺激人中穴，人中穴定位按華興邦的動物穴位圖譜，用1.7 cm毫針在大鼠鼻中隔下方向上斜刺2 mm，并在該部位下約2 mm處刺入1針作為參考電極，人中穴接電針儀的正極，參考電極接負極，用15Hz，1mA的連續(xù)波刺激，持續(xù)20min；模型對照組和空白對照組均同樣抓取固定，但不進行任何治療。

2.4 樣本制備 模型對照組、電針干預(yù)組分別在MCAO后1、3、6 h規(guī)定時間，于一側(cè)股靜脈注射生物素化番茄凝集素（1 g/L，溶于生理鹽水)，2 min后，開胸行心臟灌注，灌注液為1%多聚甲醛與0.5%戊二醛混合0.01 mol/mL PBS緩沖液，130 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa）壓力連續(xù)灌注10 min，取腦，以大腦中動脈和大腦前動脈分叉部為中點前后各2 mm取中間一塊腦組織，30%蔗糖脫水，冰凍切片，切片厚度35μm，連續(xù)切片20張，4℃丙酮固定10min，晾干后－20℃保存待檢。

2.5 染色步驟 取冰凍切片，0.01 mol/L PBS緩沖液洗5min×2次；0.01×10-3mol/mLPBS緩沖液（含0.3%Triton X-100）中，37℃孵育4 h；滴加ABC復(fù)合物，37℃孵育1 h，0.01 mol/mL PBS緩沖液洗5 min×2次；滴加DAB染色試劑反應(yīng)15 min；徹底水洗終止反應(yīng)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.6 圖像分析 采用Image Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)，對每張切片缺血半暗帶內(nèi)分別隨機選擇5個視野進行測量，檢測參數(shù)為血管量。

2.7 統(tǒng)計處理 采用SPSS13.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析。

3 實驗結(jié)果

采用Image Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)對圖像進行分析，選擇測量參數(shù)為血管總數(shù)，導(dǎo)出數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，結(jié)果見表1。

表1 缺血半暗帶內(nèi)有血流灌注的總血管量（s，n＝6）

表1 缺血半暗帶內(nèi)有血流灌注的總血管量（s，n＝6）

注：空白對照組有血流灌注的微血管數(shù)量平均為(317.00±7.40)，與空白對照組比較*P＜0.001，與模型對照組比較▲P＜0.01。

組別 梗死后1 h模型對照組 136.20±2.96*電針干預(yù)組 195.50±5.61*▲梗死后3 h 130.39±9.58*192.50±10.98*▲梗死后6 h 130.83±7.97*186.28±9.82*▲

采用凝集素組織化學技術(shù)對各組切片進行染色，空白對照組血管形態(tài)，模型對照組和電針干預(yù)組缺血半暗帶內(nèi)腦血管形態(tài)如圖所示（圖1、圖2）。

圖1 正常腦血管染色

缺血半暗帶有血流灌注的為血管量統(tǒng)計結(jié)果顯示：與空白對照組比較，模型對照組在MCAO后1、3、6 h血管量均顯著減少，有統(tǒng)計學差異（P＜0.001），電針干預(yù)組與相對應(yīng)模型對照組各時相比較，血管量均顯著增加，有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），但是仍顯著少于空白對照組（P＜0.001）。

4 結(jié)論

電針干預(yù)可增加MCAO模型大鼠缺血半暗帶內(nèi)有血流灌注的微血管數(shù)量，提示電針干預(yù)可促進側(cè)支循環(huán)建立，從而增加這一區(qū)域的腦血流灌注，并對梗死區(qū)產(chǎn)生一定的影響。

圖2 MCAO模型缺血半暗帶內(nèi)微血管形態(tài)

5 討論

腦梗死后，梗死區(qū)的微循環(huán)中，血流基本處于停滯狀態(tài)，缺血半暗帶微循環(huán)中，血流速度下降，細胞聚集度降低，越接近梗死區(qū)，下降幅度越大，呈現(xiàn)出一定的梯度變化，相比較其他部位血流速度和細胞聚集度而言，番茄凝集素更容易對這一區(qū)域的紅細胞產(chǎn)生凝集作用，使得血流停滯，凝固，并且這種作用不同于一般的血液凝固，其作用力更強，通過心臟灌注的方法，在灌注壓相同的情況下，由于灌注壓在血管系統(tǒng)中遇到阻力逐級遞減，至大腦微循環(huán)時灌注液不能將凝集素作用的血管中的血液沖洗掉。對于那些在凝集素靜脈注射前血液已經(jīng)凝固的血管，凝集素無法隨著血液流動進入這些血管，則不能與特異性糖蛋白結(jié)合，最終這些血管中凝固的血液在灌注液的作用下被沖洗掉，但由于沒有凝集素的結(jié)合，隨后的染色反應(yīng)中則不能染出。所以，根據(jù)凝集素的特殊反應(yīng)原理，筆者認為最終通過凝集素組織化學染色出現(xiàn)的微血管，可以看作是腦梗死后仍有緩慢血液流動的部分血管，這部分微循環(huán)中的血液正是由側(cè)支循環(huán)代償而來，所以能夠很好的反映腦梗死后缺血半暗帶和梗死區(qū)的微循環(huán)狀態(tài)，并以此推測側(cè)支循環(huán)建立的情況及其代償能力。

[1]James F Toole著，龍 潔譯.腦血管疾病[M].第5版，北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2004：5.

[2]宗靜杰，褚 芹，鄭建剛.“醒腦開竅”針刺法治療缺血性中風作用機制研究進展[J].天津中醫(yī)藥大學學報，2010，29（3）：164-166.