公衍玲,金宏,黃山,金巖,張丹丹

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院藥學(xué)系,山東 青島 266042)

荊芥為唇形科植物荊芥(Schizonepeta tenuif oliaBriq.)的干燥地上部分,其味辛,微溫,歸肺、肝經(jīng),具有解表散風(fēng)、透疹、消瘡、止血等功效,臨床應(yīng)用廣泛。荊芥中的主要化學(xué)成分包括揮發(fā)油類、酚類、酸類、黃酮類化合物[1],而黃酮類化合物具有降血脂、抑制血栓形成、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)痛、保肝等多種生物活性,日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[2-3]。新的提取技術(shù)和方法不斷涌現(xiàn),使黃酮類化合物的提取研究也在不斷更新和深入,其中生物酶解技術(shù)應(yīng)用于中藥提取呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。是根據(jù)植物細(xì)胞壁的構(gòu)成,利用酶反應(yīng)所具有高度專一性的特點(diǎn),選擇相應(yīng)的酶,將細(xì)胞壁的組成成分(纖維素、半纖維素和果膠質(zhì))水解或降解,破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),使細(xì)胞內(nèi)的成分溶解、混懸或膠溶于溶劑中,從而達(dá)到提取目的,且有利于提高成分的提取率[4]。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱,具有分解、軟化纖維素、破壞細(xì)胞壁、增加植物細(xì)胞內(nèi)容物的溶出量的作用,廣泛應(yīng)用于中藥有效成分的提取[5-7]。本文擬將纖維素酶用于提取荊芥總黃酮,并獲得了最佳提取工藝,現(xiàn)報(bào)導(dǎo)如下。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

荊芥,四川省綿陽(yáng)市;纖維素酶,寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;蘆丁,中國(guó)藥品生物制品檢定所;其它試劑均為市售分析純。UV762紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DHS-25型pH計(jì),上海精科雷磁;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 荊芥總黃酮的酶法提取工藝流程。準(zhǔn)確稱取荊芥5g,加入一定溫度的水中,調(diào)節(jié)介質(zhì)的pH,加入一定量的酶,恒溫提取一定時(shí)間,升溫滅酶后再用水浸提1.5h,過(guò)濾,將濾液濃縮至約100mL,待測(cè)。

1.2.2 荊芥提取物中總黃酮的測(cè)定

1.2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0 、1.0、2.0 、3.0 、4.0、5.0mL,分別置于 25mL 容量瓶中,各加30%乙醇5mL,再各精密加入5%NaNO2溶液0.7mL,搖勻,放置6min,然后再各精密加入10%Al(NO3)3溶液 0.7mL,搖勻,放置6min,最后再各精密加入1mol/L的NaOH溶液10mL,分別用30%乙醇稀釋至25mL,搖勻,放置15min后,置比色皿中,用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在510nm處測(cè)吸光度。以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為y=9.9943x+0.0103,R2=0.9997。

1.2.2.2 荊芥中總黃酮的測(cè)定:取1.2.1項(xiàng)下的濾液2mL置10mL容量瓶中,按照1.2.2.1項(xiàng)下的方法測(cè)吸光度,計(jì)算總黃酮的質(zhì)量,并計(jì)算總黃酮得率(總黃酮得率=提取液中總黃酮質(zhì)量/荊芥質(zhì)量×100%)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。影響酶法提取的因素有粉碎度、料液比、酶解溫度、酶解 pH 值、酶解時(shí)間、酶的用量,按照單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路,考查各因素對(duì)總黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,篩選影響提取的主要因素,設(shè)計(jì)了四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn),采用L9(34)表安排實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)荊芥總黃酮提取的影響

準(zhǔn)確稱取荊芥各5g,粉碎至60目、40目、30目、20目、10目,按料液比1∶10、酶解溫度 40℃、酶解 pH 值4、酶的用量 1.0%(藥材干重)、酶解時(shí)間30min處理后,煎煮1.5h,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 粉碎度對(duì)荊芥總黃酮提取的影響

隨著粉碎度的增加,總黃酮的得率總體上逐漸增加,原因可能是粉碎度的增大有利于增大溶劑與物料的接觸面積,從而有利于總黃酮的溶出。當(dāng)達(dá)到50目時(shí),總黃酮的得率變化趨于平緩,且粉碎度的增加不利于分離過(guò)濾。因此綜合考慮,選擇荊芥的粉碎度應(yīng)為50目左右。

2.1.2 料液比對(duì)酶法提取荊芥總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取50目荊芥各5g,分別加入料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16的水,在酶解溫度 40℃、酶解pH值4、酶的用量1.0%(藥材干重)、酶解時(shí)間30min處理后,煎煮1.5h,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同料液比對(duì)荊芥總黃酮提取的影響

隨著料液比的增加,總黃酮得率逐漸增加,當(dāng)料液比達(dá)到1∶12時(shí),總黃酮得率達(dá)最大值,而后隨著料液比的增加,總黃酮得率反而有所下降,但下降的趨勢(shì)不是很明顯。分析可能原因,隨著料液比的增大,反應(yīng)體系中的水分會(huì)增加,從而降低了反應(yīng)產(chǎn)物的濃度,減少了產(chǎn)物對(duì)酶促反應(yīng)的反饋抑制作用,總黃酮得率會(huì)增加,但隨著反應(yīng)體系中水分的增加,酶的濃度也會(huì)相應(yīng)的有所下降,總黃酮得率變化趨于平緩。故選擇料液比為1∶12。

2.1.3 酶解溫度對(duì)酶法提取荊芥總黃酮提取的影響

準(zhǔn)確稱取50目荊芥各5g,料液比1∶10、酶解pH值4、酶的用量1.0%(藥材干重)、酶解溫度分別設(shè)為30 、35 、40、45 、50℃,酶解 30min 后,煎煮 1.5h,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)荊芥總黃酮提取的影響

隨著溫度的升高,總黃酮得率隨之增大,在35～45℃時(shí)達(dá)到最大,而后隨著溫度的升高,總黃酮利率開(kāi)始下降降低。該纖維素酶的最適溫度為40℃,溫度過(guò)高會(huì)破壞酶的活性。

2.1.4 酶解pH對(duì)荊芥總黃酮提取的影響

準(zhǔn)確稱取50目荊芥各5g,按料液比1∶10、酶解溫度40℃、酶的用量1.0%(藥材干重)、酶解pH值分別設(shè)為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,酶解 30min 后,煎煮1.5h,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酶解pH對(duì)荊芥總黃酮提取的影響

從圖4可以看出,總黃酮得率隨著酶解液初始pH值的增大而增大,在pH=5時(shí)達(dá)到最大,繼續(xù)增大pH值,總黃酮利率反而減小。因?yàn)槔w維素酶的活力受環(huán)境pH值影響,在一定pH值下,纖維素酶的反應(yīng)達(dá)到最大速度,pH5即為該該纖維素酶的最適pH值。

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)荊芥總黃酮提取的影響

準(zhǔn)確稱取50目荊芥各5g,按料液比1∶10、酶解pH 值4、酶解溫度40℃、酶的用量1.0%(藥材干重)、酶解時(shí)間分別設(shè)為20、30、40、50、60、90、120min后 ,煎煮1.5h,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)荊芥總黃酮提取的影響

從圖5可以看出,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),總黃酮利率逐漸下降,酶解50min之后,總黃酮利率基本穩(wěn)定在一較低的水平。從理論上講,酶解反應(yīng)時(shí)間和酶解進(jìn)行程度有著密切的關(guān)系,反應(yīng)時(shí)間太短,酶解不充分,而當(dāng)酶濃度達(dá)一定值時(shí),酶促反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)并不能顯著增加浸提率,甚至開(kāi)始下降。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),酶解20min即可獲得較好的效果。

2.1.6 酶的用量對(duì)荊芥總黃酮提取的影響

準(zhǔn)確稱取50目荊芥各5g,按料液比1∶10、酶解pH值4、酶解溫度40℃、酶的用量分別設(shè)為 0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.4%(藥材干重),酶解30min后,煎煮1.5h,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 酶的用量對(duì)荊芥總黃酮提取的影響

從圖6可以看出,總黃酮得率隨著酶用量的增大而增加,當(dāng)酶用量為1.2%時(shí),其濃度為最大,繼續(xù)增加酶用量,總黃酮得率反而減小。在保持體系中其他成分不變的條件下,隨著酶用量的增加,纖維素酶與纖維素分子的接觸機(jī)會(huì)增加,在同一時(shí)間內(nèi),細(xì)胞壁中的纖維素水解速度提高,致使黃酮類化合物很快分離出來(lái);達(dá)到最大值后,隨著酶用量的增加,底物被酶分子所飽和,酶解反而有可能存在競(jìng)爭(zhēng)抑制,使酶解不徹底,另外也是酶的一種浪費(fèi)。酶的用量適宜控制在1.2%。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)考察的結(jié)果,確定酶解最適pH為5,最佳酶解溫度為40℃,其他因素選取最佳實(shí)驗(yàn)條件附近的三個(gè)水平,進(jìn)行四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn),以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 正交實(shí)驗(yàn)的方差分析表

從表1和表2可以看出,各因素對(duì)提取效果的影響為粉碎度＞酶解時(shí)間＞酶的用量＞料液比,其中粉碎度、酶解時(shí)間和酶的用量對(duì)提取率的影響均具有顯著意義。結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,最佳提取工藝條件為:藥材粉碎至50目,料液比為1∶16,酶的用量為0.8%,酶解溫度為40℃,酶解pH值為5,酶解時(shí)間為20min后,煎煮1.5h。以此提取工藝做3組驗(yàn)證試驗(yàn),其總黃酮平均得率為1.174%,說(shuō)明該工藝條件穩(wěn)定,提取率高。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照上述工藝條件進(jìn)行了三組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),其結(jié)果如表3,總黃酮的平均得率為1.174%,最高得率可達(dá)1.215%。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表

3 結(jié)論

3.1 本文通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)獲得了酶法提取總黃酮的最佳工藝條件為:荊芥藥材粉碎至50目,料液比為1∶16,酶的用量為0.8%,酶解溫度為40℃,酶解pH值為5,酶解20min后,煎煮1.5h。該工藝條件重現(xiàn)性好,荊芥總黃酮得率可高達(dá)1.215%。

3.2 酶解預(yù)處理與傳統(tǒng)水煎法相結(jié)合可用于荊芥總黃酮的提取,該法反應(yīng)條件溫和,能耗低,還可避免使用有機(jī)溶劑,從而實(shí)現(xiàn)中藥的綠色提取和清潔化生產(chǎn)。

[1]張麗,馮有龍,丁安偉,等.荊芥化學(xué)成分的研究[J].中藥材,2001,24(3):183-184

[2]周麗娜.荊芥的化學(xué)成分及藥理作用研究[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2004,22(10):1944-1945.

[3]Cazarolli LH,Zanatta L,Alberton EH,et al.Flavonoids:prospective drug candidates[J].Mini Rev Med Chem.2008,8(13):1429-1240.

[4]張立娟,于國(guó)萍,周國(guó)華.黑木耳多糖酶法提取條件的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2005,26(3):89-91.

[5]蔣蔡濱.淺談酶法在中藥提取中的應(yīng)用[J].雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,22(3):8-9.

[6]楊云,萬(wàn)焱,張寒娟,等.纖維素酶在葛根提取工藝中的應(yīng)用[J].河南科學(xué)2008,26(12):1503-1504.

[7]Salgado-Roman M,Botello-Alvarez E,Rico-M artí nez R,et al.Enzymatic treatment to improve extraction of capsaicinoids and carotenoids from chili(Capsicum annuum)fruits[J].J Agric Food Chem,2008,56(21):10012-10018.