孫曉敬，張 旭，彭 帥，姜 寧，陳啟軍

（吉林大學(xué)人獸共患病研究所 人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130062）

mindin又稱為spondin2，是一種分泌型細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（extracellular matrix protein，ECM），由spon2基因編碼。它作為一種模式識(shí)別分子，在啟動(dòng)天然免疫反應(yīng)對(duì)抗病原入侵過程中發(fā)揮著重要作用［1］。mindin最初在斑馬魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，且主要積聚在基底層［2］。后來，研究者相繼克隆出鼠源和人源［3］mindin，且發(fā)現(xiàn)其 mRNA在脾臟、肺臟及淋巴結(jié)中豐富表達(dá)［2］。cDNA編碼區(qū)包含一個(gè)330個(gè)氨基酸的開放閱讀框架，蛋白產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量為36 ku。mindin能直接與革蘭陽性和革蘭陰性菌結(jié)合，作為一種調(diào)理素輔助巨噬細(xì)胞吞噬病原體［4－5］。

通過鼻內(nèi)給藥的方法對(duì)野生型小鼠注入重組蛋白mindin，發(fā)現(xiàn)可以加強(qiáng)小鼠對(duì)鼻內(nèi)流感病毒的清除能力［3］。研究表明，在細(xì)菌、病毒等病原體感染時(shí)，mindin對(duì)于啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng)是非常重要的，有望作為一種免疫增強(qiáng)劑來加強(qiáng)機(jī)體對(duì)于外源微生物的抵抗作用［6］。

有多項(xiàng)研究表明，mindin還可起到銜接先天性免疫和獲得性免疫的橋梁作用，但其調(diào)節(jié)機(jī)制及其激活的信號(hào)通路尚未明確。推測(cè)可能的機(jī)制是，當(dāng)其識(shí)別并結(jié)合病原微生物后，啟動(dòng)天然免疫的效應(yīng)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)吞、系列炎癥細(xì)胞因子及趨化因子的合成和分泌，上調(diào)抗原遞呈細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)，誘導(dǎo)T或B淋巴細(xì)胞向效應(yīng)T或B淋巴細(xì)胞的分化，最終強(qiáng)化獲得性免疫［7］。

日本血吸蟲（Schistosomajaponicum）是生活史和生物學(xué)特性復(fù)雜、危害嚴(yán)重、防治難度大的一種血吸蟲，日本血吸蟲病更是血吸蟲病中惟一一種人獸共患?。?－9］。日本血吸蟲23ku膜蛋白（Sjc23）是四跨膜蛋白（TSP）家族的一員，在蟲體生活史各階段的膜表面均有表達(dá)，直接暴露于宿主的免疫系統(tǒng)，是宿主對(duì)蟲體免疫應(yīng)答的首要靶標(biāo)，也是目前公認(rèn)的幾種具有潛力的候選疫苗和具有診斷價(jià)值的抗原分子之一［10］。本研究利用基因工程方法，克隆表達(dá)并純化了鼠源細(xì)胞外基質(zhì)蛋白mindin，并將其與日本血吸蟲Sjc23抗原蛋白聯(lián)合免疫小鼠，采用間接ELISA檢測(cè)小鼠抗體效價(jià)，初步探討了mindin作為一種新型免疫增強(qiáng)劑，對(duì)小鼠體液免疫的增強(qiáng)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和載體 表達(dá)載體pET－22b（＋）、宿主菌DH5α，BL21（DE3）由人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、膠回收試劑盒及質(zhì)粒抽屜試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨和SDS為Sigma公司產(chǎn)品；異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）為Amresco公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑、瓊脂糖為Promega公司產(chǎn)品；蛋白胨和酵母提取物為Oxoid公司產(chǎn)品；溶菌酶為Merck公司產(chǎn)品；His GraviTrap affinity columns為GE Healthcare公司產(chǎn)品；抗His單克隆抗體、二抗均為Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 目的片段擴(kuò)增及克隆 參照GenBank中鼠源Spon2基因全序列（NC－000071），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司優(yōu)化為大腸埃希菌偏愛密碼子后合成全序列。設(shè)計(jì)引物，上游引物P1：5′－GGATCCGCAGCCTCTGGGTGGTGAATCC－3′，下游引物 P2：5′－AAGCTTTACGCAATTGTCCGGAACGC－3′。上下游引物各加入BamH I和HindⅢ酶切位點(diǎn)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。預(yù)期擴(kuò)增mindin基因完整ORF長(zhǎng)度為990bp。PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃1min；60℃45s；72℃ 45s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。10g／L瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并回收目的片段，連接pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α，抽提質(zhì)粒，雙酶切鑒定送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。所得陽性重組質(zhì)粒用BamH I和HindⅢ雙酶切，連接原核表達(dá)載體pET－22b（＋），轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α，抽提質(zhì)粒，雙酶切鑒定后送出測(cè)序，其所得陽性重組質(zhì)粒命名為pET22b－mindin。

1.2.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物檢測(cè) 質(zhì)粒pET22b－Mindin轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21（DE3）菌感受態(tài)，挑取單克隆培養(yǎng)后用PCR鑒定，陽性克隆培養(yǎng)物以1%接種LB培養(yǎng)基（50mg／L氨芐），37℃搖蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600＝0.6～1.0）時(shí)，加入終濃度為0.1mmol／L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2h～4h。收集表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS－PAGE電泳和Western blot分析。

1.2.3 表達(dá)產(chǎn)物的純化及復(fù)性

（1）表達(dá)產(chǎn)物純化 離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體用PBS重懸超聲破碎，離心收集沉淀。沉淀用含1 mol／L NaCl、5mL／L TritonX－100的1mol／L和2 mol／L尿素的20mmol／L Tris－HCl（pH 8.0）緩沖液分別洗滌2次，最后用Binding buffer［含8mol／L尿素、500mmol／L NaCl、5mmol／L咪唑、1mmol／L β－巰基乙醇的20mmol／L Tris－HCl（pH 8.0）］室溫溶解過夜，15 000r／min離心10min，收集上清液，用Ni－NTA柱（Qiagen公司）純化，具體方法參見Ni－NTA說明書。

（2）包涵體復(fù)性 將純化后的目的蛋白用Elution buffer［含 8mol／L 尿 素、500mmol／L NaCl、500 mmol／L咪唑、1mmol／Lβ－巰基乙醇的20mmol／L Tris－HCl（pH 8.0）］稀釋至終濃度1.5mg／mL ，攪拌混勻后裝入預(yù)先處理好的透析袋中，兩端用透析袋夾夾緊，將透析袋放入裝有復(fù)性液的燒杯中，置4℃冰箱中的磁力攪拌器上透析。復(fù)性液為尿素濃度遞減（分別為6、4、3、2、1mol／L）的含0.5mol／L精氨酸的PBS（pH 7.4）溶液，每一梯度復(fù)性液透析12h。然后將復(fù)性液中的精氨酸濃度逐級(jí)遞減（分別為0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mol／L），同樣，每一梯度透析12h，最后用PBS透析12h，收集透析袋中液體測(cè)定蛋白濃度。

1.2.4 重組蛋白 mindin－His與日本血吸蟲sjc23抗原聯(lián)合免疫小鼠 取32只6周齡～8周齡Balb／c小鼠，隨機(jī)分為3組，每組8只。第1組免疫弗氏佐劑乳化的sjc23，其中第1次免疫使用弗氏完全佐劑，第2～3次免疫使用弗氏不完全佐劑；第2組聯(lián)合免疫重組蛋白質(zhì)和sjc23；第3組單獨(dú)免疫sjc23。每隔3周肌肉注射1次，每次每只小鼠免疫10μg，總體積為100μL。每次免疫2周后尾尖取血并分離血清，保存于－80℃。間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)，并對(duì)3組間的結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 Spon2基因的擴(kuò)增與克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增后，獲得約990bp特異性Spon2片段；回收該片段與pMD18－T載體相連，再用BamH I和HindⅢ雙酶切鑒定，獲得約990bp、2 700bp兩條帶；測(cè)序結(jié)果顯示與已登錄序列完全一致；重組質(zhì)粒pET22b－mindin經(jīng)雙酶切得5 500 bp的載體片段和990bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，表明該原核表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖1、圖2）。

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE和 Western blot鑒定

重組質(zhì)粒pET22b－mindin在BL21中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)出36ku的蛋白，而未經(jīng)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒對(duì)照及誘導(dǎo)的空載體在下相應(yīng)處幾乎沒有表達(dá)帶；純化的融合蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳，在36ku處有單一條帶；Western blot分析表明，復(fù)性表達(dá)產(chǎn)物能與6－His組氨酸單克隆抗體特異性結(jié)合，在硝酸纖維素膜上形成一特異條帶（圖3～圖5）。

圖1 spon2基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 Analysis of spon2gene by PCR amplification

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b－mindin（BamHⅠ＋HindⅢ）雙酶切分析Fig.2 Analysis of recombinatnt plasmid pET22b－mindin digested with BamHⅠ＋HindⅢ

圖3 SDS－PAGE分析重組蛋白rmindin的表達(dá)Fig.3 The identification of recombinant protein rmindin by SDS－PAGE

圖4 融合蛋白純化后的SDS－PAGE分析Fig.4 Analysis of purified protein by SDS－PAGE

2.3 聯(lián)合免疫對(duì)小鼠體液免疫的影響

采用間接ELISA對(duì)3組試驗(yàn)小鼠每次的免疫血清進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)（圖4），弗氏佐劑組和mindin＋Sj23組在一免時(shí)就產(chǎn)生抗體，兩組的抗體應(yīng)答反應(yīng)無顯著差異。而Sj23對(duì)照組在二免時(shí)才產(chǎn)生抗體，其OD值仍低于弗氏佐劑組和mindin＋Sj23組（圖6）。

圖5 重組蛋白質(zhì)rmindin的Western blot分析Fig.5 Analysis of rmindin by Western blot

圖6 聯(lián)合免疫后抗體效價(jià)動(dòng)態(tài)變化Fig.6 Dynamic changes in antibody titer after combined immunodeficiency

3 討論

微生物通過一系列表面分子結(jié)合到宿主細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）組分上，進(jìn)而建立有效的感染。在ECM組分與入侵微生物相互作用的早期，ECM組分可能積極參與到免疫防御中（作為PRRS的一個(gè)整體部分防御微生物感染）。ECM不僅可以給組織提供結(jié)構(gòu)骨架，還能調(diào)節(jié)與骨架接觸的細(xì)胞的行為，細(xì)胞和ECM組分間的相互關(guān)系影響細(xì)胞黏附，遷移，增殖和分化［11］。ECM可以作為微生物在宿主內(nèi)定居的結(jié)合位點(diǎn)，病原體以其細(xì)胞表面配基結(jié)合纖維粘連蛋白，膠原，玻璃黏連蛋白和凝血酶敏感素等ECM組分［12］，當(dāng)病原體結(jié)合到這些組分后，可以此作為駐扎地，進(jìn)而向機(jī)體其他部分?jǐn)U散和延伸，因此認(rèn)為ECM組分作為微生物病原體入侵機(jī)體的停泊位點(diǎn)，但是個(gè)別ECM 組分在體內(nèi)的功能仍然未知［13］。mindin是分泌型ECM蛋白中mindin－F－spondin家族中的一員，能夠特異性結(jié)合細(xì)菌的脂多糖成分，作為吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的調(diào)理素發(fā)揮功能，最終將細(xì)菌清除掉。mindin可以促使機(jī)體清除鼻內(nèi)感染的流感病毒，mindin缺陷型小鼠肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬功能明顯受損，其與對(duì)照組相比，鼻內(nèi)及肺勻漿組織中的病毒滴度明顯高出10倍之多。因此，mindin對(duì)于啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng)是必不可少的，是ECM中一種針對(duì)微生物病原體的獨(dú)特的模式識(shí)別分子。

大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、目的基因表達(dá)水平高、培養(yǎng)周期短、便于純化檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)［14］。本試驗(yàn)所用的pET－22b載體屬于pET系列載體中高水平表達(dá)目的基因的一種，能顯著增加目的蛋白的可溶性，促進(jìn)目的蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。但mindin的氨基酸組成中，疏水性氨基酸占到了總氨基酸數(shù)的1／3以上，且屬于真核生物蛋白，在大腸埃希菌中的表達(dá)缺乏翻譯后的氨基酸修飾功能，這可能是導(dǎo)致mindin以包涵體形式表達(dá)的主要原因。

日本血吸蟲是一種寄生于人類血液以紅細(xì)胞為營養(yǎng)來源的多細(xì)胞生物，Sjc23作為首個(gè)在日本血吸蟲蟲被鑒定出來的四跨膜蛋白，被視為潛在的疫苗候選抗原之一［15］.同時(shí)，Sjc23又是日本血吸蟲的一種免疫調(diào)節(jié)抗原，不利于機(jī)體抵抗血吸蟲的入侵［16］。本研究中，將mindin作為一種生物佐劑，刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)地針對(duì)Sjc23的體液免疫，其免疫增強(qiáng)效果在小鼠體內(nèi)效果與弗氏佐劑無顯著差異。mindin是小鼠自源性蛋白質(zhì)，毒副作用小，更容易被機(jī)體吸收利用，安全性高。本研究為今后深入研究mindin的免疫增強(qiáng)功能及增強(qiáng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

［1］He Y W，Li H，Zhang J，et al.The extracellular matrix protein mindin is a pattern－recognition molecule for microbial pathogens［J］.Nat Immunol，2004，5（1）：88－97.

［2］Klar A，Baldassare M，Jessell T M.F－spondin：agene expressed at high levels in the floor plate encodes a secreted protein that promotes neural cell adhesion and neurite extension［J］.Cell，1992，69（1）：95－110.

［3］Wei J，Hong L，He Y W.Pattern recognition molecule mindin promotes intranasal clearance of influenza viruses［J］.J Immunol，2008，180（6）：255－261.

［4］孫 巖，王 路，溫俊歌，等.β－防御素在天然免疫中的作用［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（5）：120－121.

［5］侯佩莉，張茂林，李 影，等.A型流感病毒感染免疫應(yīng)答中的細(xì)胞因子的作用［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（10）：108－110.

［6］Jia，W，Li H，He Y W.The extracellular matrix protein mindin serves as an integrin ligand and is critical for inflammatory cell recruitment［J］.Blood，2005，106（38）：54－59.

［7］Takeuchi O，Akira S.Pattern Recognition Receptors and Inflammation［J］.Cell，2010，140（2）：805－820.

［8］Fenwick A，Webster J P.Schistosomiasis：challenges for control，treatment and drug resistance［J］.Curr Opin Infect Dis，2006，19（5）：77－82.

［9］He Y X，Salafsky B，Ramaswamy K.Host－－parasite relationships of Schistosoma japonicum in mammalian hosts［J］.Trends Parasitol，2001，17（3）：20－24.

［10］Wu C，Cai P，Chang Q，et al.Mapping the binding between the tetraspanin molecule（Sjc23）of Schistosoma japonicum and human non－immune IgG［J］.PLoS One，2011，6（4）：106－112.

［11］李國勤，盧立志.動(dòng)物關(guān)鍵模式識(shí)別受體及其看病毒天然免疫作用研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué)，2011，23（1）：78.

［12］Murakoshi M，Tanimoto M，Gohda T，et al.mindin：a novel marker for podocyte injury in diabetic nephropathy［J］.Nephrol Dial Transplant，2011，26（7）：53－60.

［13］Okamura Y.The extra domain A of fibronectin activates Tolllike receptor 4［J］.Biol Chem，2001，276（10）：229－233.

［14］曾 爽，陳國華，崔 青，等.豬 MyD88基因的原核表達(dá)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（12）：3－5.

［15］徐妮為，田 智，汪世平.日本血吸蟲病DNA疫苗的研究進(jìn)展［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2010，5（10）：786－788.

［16］Liu F，Lu J，Hu W，Wang S Y，et al.New perspectives on host－parasite interplay by comparative transcriptomic and proteomic analyses ofSchistosomajaponicum［J］.PLoS Pathog，2006，2（4）：e29.