孫曉敬，張 旭，彭 帥，姜 寧，陳啟軍

（吉林大學人獸共患病研究所 人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林長春 130062）

mindin又稱為spondin2，是一種分泌型細胞外基質(zhì)蛋白（extracellular matrix protein，ECM），由spon2基因編碼。它作為一種模式識別分子，在啟動天然免疫反應對抗病原入侵過程中發(fā)揮著重要作用［1］。mindin最初在斑馬魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，且主要積聚在基底層［2］。后來，研究者相繼克隆出鼠源和人源［3］mindin，且發(fā)現(xiàn)其 mRNA在脾臟、肺臟及淋巴結(jié)中豐富表達［2］。cDNA編碼區(qū)包含一個330個氨基酸的開放閱讀框架，蛋白產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量為36 ku。mindin能直接與革蘭陽性和革蘭陰性菌結(jié)合，作為一種調(diào)理素輔助巨噬細胞吞噬病原體［4－5］。

通過鼻內(nèi)給藥的方法對野生型小鼠注入重組蛋白mindin，發(fā)現(xiàn)可以加強小鼠對鼻內(nèi)流感病毒的清除能力［3］。研究表明，在細菌、病毒等病原體感染時，mindin對于啟動先天性免疫反應是非常重要的，有望作為一種免疫增強劑來加強機體對于外源微生物的抵抗作用［6］。

有多項研究表明，mindin還可起到銜接先天性免疫和獲得性免疫的橋梁作用，但其調(diào)節(jié)機制及其激活的信號通路尚未明確。推測可能的機制是，當其識別并結(jié)合病原微生物后，啟動天然免疫的效應機制，實現(xiàn)細胞內(nèi)吞、系列炎癥細胞因子及趨化因子的合成和分泌，上調(diào)抗原遞呈細胞表面共刺激分子的表達，誘導T或B淋巴細胞向效應T或B淋巴細胞的分化，最終強化獲得性免疫［7］。

日本血吸蟲（Schistosomajaponicum）是生活史和生物學特性復雜、危害嚴重、防治難度大的一種血吸蟲，日本血吸蟲病更是血吸蟲病中惟一一種人獸共患?。?－9］。日本血吸蟲23ku膜蛋白（Sjc23）是四跨膜蛋白（TSP）家族的一員，在蟲體生活史各階段的膜表面均有表達，直接暴露于宿主的免疫系統(tǒng)，是宿主對蟲體免疫應答的首要靶標，也是目前公認的幾種具有潛力的候選疫苗和具有診斷價值的抗原分子之一［10］。本研究利用基因工程方法，克隆表達并純化了鼠源細胞外基質(zhì)蛋白mindin，并將其與日本血吸蟲Sjc23抗原蛋白聯(lián)合免疫小鼠，采用間接ELISA檢測小鼠抗體效價，初步探討了mindin作為一種新型免疫增強劑，對小鼠體液免疫的增強作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和載體 表達載體pET－22b（＋）、宿主菌DH5α，BL21（DE3）由人獸共患病研究教育部重點實驗室提供。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、DNA分子質(zhì)量標準、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準、膠回收試劑盒及質(zhì)粒抽屜試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨和SDS為Sigma公司產(chǎn)品；異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）為Amresco公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑、瓊脂糖為Promega公司產(chǎn)品；蛋白胨和酵母提取物為Oxoid公司產(chǎn)品；溶菌酶為Merck公司產(chǎn)品；His GraviTrap affinity columns為GE Healthcare公司產(chǎn)品；抗His單克隆抗體、二抗均為Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 目的片段擴增及克隆 參照GenBank中鼠源Spon2基因全序列（NC－000071），由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司優(yōu)化為大腸埃希菌偏愛密碼子后合成全序列。設計引物，上游引物P1：5′－GGATCCGCAGCCTCTGGGTGGTGAATCC－3′，下游引物 P2：5′－AAGCTTTACGCAATTGTCCGGAACGC－3′。上下游引物各加入BamH I和HindⅢ酶切位點，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。預期擴增mindin基因完整ORF長度為990bp。PCR反應條件：94℃5min；94℃1min；60℃45s；72℃ 45s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。10g／L瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物并回收目的片段，連接pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α，抽提質(zhì)粒，雙酶切鑒定送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序。所得陽性重組質(zhì)粒用BamH I和HindⅢ雙酶切，連接原核表達載體pET－22b（＋），轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α，抽提質(zhì)粒，雙酶切鑒定后送出測序，其所得陽性重組質(zhì)粒命名為pET22b－mindin。

1.2.2 重組質(zhì)粒的誘導表達及產(chǎn)物檢測 質(zhì)粒pET22b－Mindin轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21（DE3）菌感受態(tài)，挑取單克隆培養(yǎng)后用PCR鑒定，陽性克隆培養(yǎng)物以1%接種LB培養(yǎng)基（50mg／L氨芐），37℃搖蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600＝0.6～1.0）時，加入終濃度為0.1mmol／L的IPTG誘導表達2h～4h。收集表達產(chǎn)物進行SDS－PAGE電泳和Western blot分析。

1.2.3 表達產(chǎn)物的純化及復性

（1）表達產(chǎn)物純化 離心收集誘導表達的菌體用PBS重懸超聲破碎，離心收集沉淀。沉淀用含1 mol／L NaCl、5mL／L TritonX－100的1mol／L和2 mol／L尿素的20mmol／L Tris－HCl（pH 8.0）緩沖液分別洗滌2次，最后用Binding buffer［含8mol／L尿素、500mmol／L NaCl、5mmol／L咪唑、1mmol／L β－巰基乙醇的20mmol／L Tris－HCl（pH 8.0）］室溫溶解過夜，15 000r／min離心10min，收集上清液，用Ni－NTA柱（Qiagen公司）純化，具體方法參見Ni－NTA說明書。

（2）包涵體復性 將純化后的目的蛋白用Elution buffer［含 8mol／L 尿 素、500mmol／L NaCl、500 mmol／L咪唑、1mmol／Lβ－巰基乙醇的20mmol／L Tris－HCl（pH 8.0）］稀釋至終濃度1.5mg／mL ，攪拌混勻后裝入預先處理好的透析袋中，兩端用透析袋夾夾緊，將透析袋放入裝有復性液的燒杯中，置4℃冰箱中的磁力攪拌器上透析。復性液為尿素濃度遞減（分別為6、4、3、2、1mol／L）的含0.5mol／L精氨酸的PBS（pH 7.4）溶液，每一梯度復性液透析12h。然后將復性液中的精氨酸濃度逐級遞減（分別為0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mol／L），同樣，每一梯度透析12h，最后用PBS透析12h，收集透析袋中液體測定蛋白濃度。

1.2.4 重組蛋白 mindin－His與日本血吸蟲sjc23抗原聯(lián)合免疫小鼠 取32只6周齡～8周齡Balb／c小鼠，隨機分為3組，每組8只。第1組免疫弗氏佐劑乳化的sjc23，其中第1次免疫使用弗氏完全佐劑，第2～3次免疫使用弗氏不完全佐劑；第2組聯(lián)合免疫重組蛋白質(zhì)和sjc23；第3組單獨免疫sjc23。每隔3周肌肉注射1次，每次每只小鼠免疫10μg，總體積為100μL。每次免疫2周后尾尖取血并分離血清，保存于－80℃。間接ELISA檢測抗體效價，并對3組間的結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果

2.1 Spon2基因的擴增與克隆、表達載體的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴增后，獲得約990bp特異性Spon2片段；回收該片段與pMD18－T載體相連，再用BamH I和HindⅢ雙酶切鑒定，獲得約990bp、2 700bp兩條帶；測序結(jié)果顯示與已登錄序列完全一致；重組質(zhì)粒pET22b－mindin經(jīng)雙酶切得5 500 bp的載體片段和990bp的目的片段，與預期結(jié)果相符，表明該原核表達載體構(gòu)建成功（圖1、圖2）。

2.2 表達產(chǎn)物的SDS－PAGE和 Western blot鑒定

重組質(zhì)粒pET22b－mindin在BL21中經(jīng)誘導表達出36ku的蛋白，而未經(jīng)誘導的重組質(zhì)粒對照及誘導的空載體在下相應處幾乎沒有表達帶；純化的融合蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳，在36ku處有單一條帶；Western blot分析表明，復性表達產(chǎn)物能與6－His組氨酸單克隆抗體特異性結(jié)合，在硝酸纖維素膜上形成一特異條帶（圖3～圖5）。

圖1 spon2基因的PCR擴增Fig.1 Analysis of spon2gene by PCR amplification

圖2 重組表達質(zhì)粒pET22b－mindin（BamHⅠ＋HindⅢ）雙酶切分析Fig.2 Analysis of recombinatnt plasmid pET22b－mindin digested with BamHⅠ＋HindⅢ

圖3 SDS－PAGE分析重組蛋白rmindin的表達Fig.3 The identification of recombinant protein rmindin by SDS－PAGE

圖4 融合蛋白純化后的SDS－PAGE分析Fig.4 Analysis of purified protein by SDS－PAGE

2.3 聯(lián)合免疫對小鼠體液免疫的影響

采用間接ELISA對3組試驗小鼠每次的免疫血清進行效價檢測（圖4），弗氏佐劑組和mindin＋Sj23組在一免時就產(chǎn)生抗體，兩組的抗體應答反應無顯著差異。而Sj23對照組在二免時才產(chǎn)生抗體，其OD值仍低于弗氏佐劑組和mindin＋Sj23組（圖6）。

圖5 重組蛋白質(zhì)rmindin的Western blot分析Fig.5 Analysis of rmindin by Western blot

圖6 聯(lián)合免疫后抗體效價動態(tài)變化Fig.6 Dynamic changes in antibody titer after combined immunodeficiency

3 討論

微生物通過一系列表面分子結(jié)合到宿主細胞外基質(zhì)（ECM）組分上，進而建立有效的感染。在ECM組分與入侵微生物相互作用的早期，ECM組分可能積極參與到免疫防御中（作為PRRS的一個整體部分防御微生物感染）。ECM不僅可以給組織提供結(jié)構(gòu)骨架，還能調(diào)節(jié)與骨架接觸的細胞的行為，細胞和ECM組分間的相互關(guān)系影響細胞黏附，遷移，增殖和分化［11］。ECM可以作為微生物在宿主內(nèi)定居的結(jié)合位點，病原體以其細胞表面配基結(jié)合纖維粘連蛋白，膠原，玻璃黏連蛋白和凝血酶敏感素等ECM組分［12］，當病原體結(jié)合到這些組分后，可以此作為駐扎地，進而向機體其他部分擴散和延伸，因此認為ECM組分作為微生物病原體入侵機體的停泊位點，但是個別ECM 組分在體內(nèi)的功能仍然未知［13］。mindin是分泌型ECM蛋白中mindin－F－spondin家族中的一員，能夠特異性結(jié)合細菌的脂多糖成分，作為吞噬細胞吞噬細菌的調(diào)理素發(fā)揮功能，最終將細菌清除掉。mindin可以促使機體清除鼻內(nèi)感染的流感病毒，mindin缺陷型小鼠肺泡巨噬細胞的吞噬功能明顯受損，其與對照組相比，鼻內(nèi)及肺勻漿組織中的病毒滴度明顯高出10倍之多。因此，mindin對于啟動先天性免疫反應是必不可少的，是ECM中一種針對微生物病原體的獨特的模式識別分子。

大腸埃希菌表達系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、目的基因表達水平高、培養(yǎng)周期短、便于純化檢測等優(yōu)點［14］。本試驗所用的pET－22b載體屬于pET系列載體中高水平表達目的基因的一種，能顯著增加目的蛋白的可溶性，促進目的蛋白的穩(wěn)定表達。但mindin的氨基酸組成中，疏水性氨基酸占到了總氨基酸數(shù)的1／3以上，且屬于真核生物蛋白，在大腸埃希菌中的表達缺乏翻譯后的氨基酸修飾功能，這可能是導致mindin以包涵體形式表達的主要原因。

日本血吸蟲是一種寄生于人類血液以紅細胞為營養(yǎng)來源的多細胞生物，Sjc23作為首個在日本血吸蟲蟲被鑒定出來的四跨膜蛋白，被視為潛在的疫苗候選抗原之一［15］.同時，Sjc23又是日本血吸蟲的一種免疫調(diào)節(jié)抗原，不利于機體抵抗血吸蟲的入侵［16］。本研究中，將mindin作為一種生物佐劑，刺激機體產(chǎn)生更強地針對Sjc23的體液免疫，其免疫增強效果在小鼠體內(nèi)效果與弗氏佐劑無顯著差異。mindin是小鼠自源性蛋白質(zhì)，毒副作用小，更容易被機體吸收利用，安全性高。本研究為今后深入研究mindin的免疫增強功能及增強機制奠定基礎(chǔ)。

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