黨 巖，馬志宏，茍想珍，孫春香，余四九，李引乾，楊鳴琦，陳德坤，秦大衛(wèi)

（1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070；3.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；4.甘肅省農(nóng)村能源辦公室，甘肅蘭州 730070）

禿瘡花（Dicranostigmaleptopodum（Maxim）Fedde）為罌粟科禿瘡花屬二年生或多年生草本植物，主要分布在甘肅、陜西、河南、山西、青海、寧夏、四川、云南、西藏等省區(qū)。近年來，我國多位研究者對禿瘡花的成分和禿瘡花制劑的藥理作用進行了研究。暢行若等［1］從禿瘡花中提取了4種結(jié)晶，經(jīng)鑒定分別為異紫堇堿、原阿片堿、紫堇堿、二十九碳醇；黨巖等［2］從禿瘡花中提取了6種結(jié)晶，經(jīng)鑒定分別為禿瘡花堿、異紫堇堿、紫堇堿、原阿片堿、別隱品堿、青風藤堿，其中禿瘡花堿為新化合物，隱品堿和青風藤堿為首次從該植物中分離得到。盧賢昭等［3］研究表明，禿瘡花對結(jié)核病有良好的治療作用，治愈療效79.5%以上。陳正山、龔艷妮等［4－12］等研究證明，禿瘡花對動物免疫系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用，有一定的抗菌、抗病菌和抗真菌作用，在外科瘡傷和抗腫瘤方面均有應用。

為了盡快將禿瘡花制劑應用于獸醫(yī)臨床實踐，在研究禿瘡花生物堿成分［2］、禿瘡花制劑的質(zhì)量標準和應用的同時［5，13］，對甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所研制的禿瘡花水溶性制劑進行毒性測定試驗，為進一步臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物和雞胚 家兔，購自平?jīng)霎數(shù)剞r(nóng)戶，體重2kg～3kg；昆明系小鼠，18g～22g，購于蘭州生物制品研究所；犢牛為平?jīng)鲠轻紖^(qū)牛場健康犢牛；雞胚為SPF蛋，購于山東昊泰實驗動物繁育有限公司，經(jīng)甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所生物技術(shù)實驗室在孵化箱孵化至9日齡～11日齡。

1.1.2 試驗器材和試劑 KH2PO4、Na2HPO4、NaCl、胰酶、檸檬酸鈉、199培養(yǎng)基（粉劑）、水解乳蛋白、胰酶等藥品為上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司產(chǎn)品；脫毛劑為平?jīng)龌瘖y品公司產(chǎn)品。二氧化碳培養(yǎng)箱、冰箱、高壓消毒鍋、細胞培養(yǎng)瓶等儀器使用甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所中心實驗室儀器。

禿瘡花水溶性制劑：甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所制備，批號分別為20070305和20080711。

1.2 方法

1.2.1 禿瘡花水溶性制劑對家兔皮膚刺激試驗

（1）家兔處理 家兔購回后，隔離觀察1周，確保健康后分組。試驗前24h對背部用脫毛劑脫毛。去毛范圍左、右各3cm×3cm，在用藥部位劃“井”字并以滲血為度。

（2）家兔分組及給藥方法 設3個試驗組和一個賦形劑對照組，每組4只家兔，雌雄各半。第1試驗組：取禿瘡花水劑30mL，隔水蒸溜濃縮至膏狀，每只家兔取1／10直接涂布于一側(cè)已去毛的皮膚上，然后用二層紗布（2.5cm×2.5cm）和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定；另一側(cè)涂0.5g脫毛劑作對照（對照不劃“＃”）。第2試驗組：取禿瘡花外用粉劑2.0g，用滅菌蒸溜水溶成膏狀，每只家兔取1／4直接涂布于一側(cè)已去毛的皮膚上，然后用二層紗布（2.5cm×2.5cm）和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定；另一側(cè)取1.0g醫(yī)用淀粉用滅菌蒸溜水溶成膏狀，每只家兔取1／4直接涂布于一側(cè)已去毛的皮膚上作對照。第3試驗組：每只家兔取禿瘡花外用敷劑受試物0.2g直接涂布于一側(cè)已去毛的皮膚上，然后用二層紗布（2.5cm×2.5cm）和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定；另一側(cè)涂0.2mL柑橄油作對照。各試驗組貼敷時間72h。貼敷結(jié)束后，除去受試物并用溫水清潔給藥部位。間隔1周后在同一部位用同樣的方法給藥，每次給藥時間相同，重復2次。賦形劑組動物的處理同試驗組。

（3）皮膚刺激試驗結(jié)果觀察標準 在自然光下觀察皮膚反應。按表1給出的評分標準對皮膚紅斑和水腫進行評分。在去除藥物后30min～60min，24、48、72h肉眼觀察并記錄涂敷部位有無紅斑和水腫等情況，按表2進行刺激強度評價。首先計算每一觀察時間點各組積分均值，然后計算觀察期限內(nèi)每天每只動物積分均值［14］。

表1 皮膚刺激反應評分標準Table 1 Grade of skin irritation

表2 皮膚刺激強度評價標準Table 2 Intensity evaluation criteria of skin irritation

1.2.2 禿瘡花水溶性制劑對犢牛睪丸細胞的毒性試驗

（1）試驗準備 以禿瘡花水溶性制劑（含氮量1.67%）的0.2mL為1個單位，用濃縮和稀釋的方法按31、30、3－1、3－2個單位（／0.1mL）分別配制藥劑10mL，4℃保存?zhèn)溆?。按常?guī)方法用細胞培養(yǎng)瓶（100mL）培養(yǎng)犢牛睪丸細胞，3d～5d后選擇35個成單層的細胞瓶備用。

（2）試驗方法 將35個細胞瓶隨機分成5組，分別為4個試驗組和1個對照組。在無菌試驗室棄營養(yǎng)液后，用31、30、3－1、3－2個單位的藥劑和生理鹽水，每個瓶分別接種0.1mL相應試驗組的藥劑或生理鹽水，并加10mL維持液，在室溫作用30min，置37℃培養(yǎng)觀察7d。在對照組7個細胞瓶的單層細胞正常的前提下，計錄試驗結(jié)果，并用Reed－Muensch法［15］計算 LD50。

1.2.3 禿瘡花水溶性制劑對雞胚的毒性試驗方法

（1）試驗準備 以禿瘡花水溶性制劑（含氮量1.67%）的0.2mL為1個單位，用濃縮和稀釋的方法按32、31、30、3－1、3－2個單位（／0.1mL）分別配制藥劑10mL，4℃保存?zhèn)溆?。選擇孵化至9日齡～11日齡雞胚30個備用。

（2）試驗方法 將30個9日齡～11日齡雞胚隨機分成6組，分別為5個試驗組和1個對照組。用32、31、30、3－1、3－2（／0.1mL）的藥劑和生理鹽水，分別在9日齡～11日齡日齡雞胚的尿囊絨毛腔每個胚接種0.1mL，各接5個胚。每天用照蛋器在暗室觀察2次，觀察5d。在對照組全部存活的前提下計錄試驗結(jié)果，并用 Reed－Muensch法［15］計算LD50。

1.2.4 禿瘡花水溶性制劑對小鼠LD50的測定

（1）小鼠分組 昆明系小鼠100只（雌雄各半），觀察5d。選擇70只小鼠隨機分成7組，每組10只（雌雄各半）。其中2組進行半數(shù)致死量預試驗，5組進行正式試驗。

其實沒什么好看的，但方玫卻把那個夜晚牢牢地記在了心底，那些風，那些燈，還有，那個人。自那以后，兩人間就有些說不清道不明的感覺。

（2）試驗方法 按寇氏Karber法測定半數(shù)致死量（LD50）。先進行半數(shù)致死量預試驗，對小鼠稱重，按0.2mL／10g腹腔注射禿瘡花內(nèi)用制劑。連續(xù)觀察7d，統(tǒng)計死亡小鼠數(shù)，確定的100%致死量（LD100）和0%致死量（LD0）范圍區(qū)間；然后根據(jù)預試驗結(jié)果分組后進行正式試驗。

（3）半數(shù)致死量（LD50）計算

LD50按以下公式計算：

LD50的95%可信限按下式計算：

其中：Sx50為lgLD50的標準誤；Xm為最大劑量組劑量的對數(shù)；d為相鄰兩組高劑量與低劑量之比的對數(shù)；P為各組動物的死亡率；ΣP為各組動物死亡率的總和；n為每組動物數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 禿瘡花水溶性制劑對家兔的皮膚刺激試驗

禿瘡花水溶性外用制劑對家兔的皮膚刺激試驗結(jié)果見表3。

從表3可以看到禿瘡花水溶性制劑、佐劑和脫毛劑對家兔皮膚無刺激性，這說明禿瘡花水溶性制劑是安全的。

2.2 禿瘡花水溶性內(nèi)用針劑對犢牛睪丸細胞的毒性試驗結(jié)果

禿瘡花內(nèi)用針劑對犢牛睪丸細胞的毒性試驗結(jié)果見表4，LD50＝3－0.76（0.43個試驗單位）。

2.3 禿瘡花水溶性內(nèi)用針劑對雞胚的毒性試驗結(jié)果

禿瘡花內(nèi)用針劑對雞胚的毒性試驗結(jié)果見表5，LD50＝3－0.32（0.70個試驗單位）。

2.4 禿瘡花水溶性內(nèi)用針劑的小鼠LD50預試驗結(jié)果

2.4.1 禿瘡花水溶性內(nèi)用針劑的小鼠LD50預試驗結(jié)果 禿瘡花水溶性針劑的小鼠LD50預試驗結(jié)果見表6。

2.4.2 禿瘡花水溶性針劑的小鼠LD50試驗結(jié)果禿瘡花水溶性針劑的小鼠LD50試驗結(jié)果見表7。經(jīng)計算，LD50＝1 776.2mg／kg；FL＝1 584.1mg／kg～1 991.6mg／kg。

表3 家兔皮膚刺激試驗結(jié)果Table 3 Test results of skin irritation in rabbit

表4 禿瘡花內(nèi)用針劑對犢牛睪丸細胞的毒性試驗結(jié)果Table 4 LD50test results of newborn calf testicular cells in injection of Dicranostigma leptopodum

表5 禿瘡花針劑對雞胚LD50試驗結(jié)果Table 5 LD50test results of chicken embryos in injection of Dicranostigma leptopodum

表6 預試驗結(jié)果Table 6 Pre－test results

表7 小鼠LD50試驗結(jié)果Table 7 The test results of mice LD50

從計算結(jié)果和我國有關(guān)急性毒性劑量分級判定標 準［14］：LD50＜20mg／kg 為 劇 毒；LD50在 20 mg／kg～200mg／kg為高毒；LD50在200mg／kg～2 000mg／kg為低毒；LD50＞2 000mg／kg為無毒。甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所研制的禿瘡花水溶性制劑屬于低毒制劑，并接近無毒。

3 討論

從試驗結(jié)果可以看出，禿瘡花水溶性制劑對動物皮膚無刺激，對犢牛睪丸細胞、雞胚和小鼠的LD50分別為 0.43、0.70個試驗單位和 1 776.2 mg／kg。這說明禿瘡花水溶性制劑對動物皮膚無毒，在動物體內(nèi)有低毒，并接近無毒制劑，對動物的毒性作用較小，在制劑質(zhì)量和劑量的監(jiān)控下完全可以應用于獸醫(yī)臨床。小鼠對禿瘡花的水溶性制劑的耐受程度明顯地高于細胞、雞胚，這說明動物機體對禿瘡花的水溶性制劑的耐受性明顯地高于細胞和胚胎，這為獸醫(yī)臨床用藥提供了指導作用，為禿瘡花制劑的研制和應用提供了可靠的試驗數(shù)據(jù)。陳正山等［3－4］在試驗中所用禿瘡花制劑均來自于甘肅省肝病結(jié)核病研究所1995年－2003年期間，由甘肅省肝病結(jié)核病研究所盧賢昭先生委托，甘肅省肝病結(jié)核病研究所的禿瘡花針劑由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所制造，對小鼠的LD50為16.39±1.10g／kg，但未見詳細的毒理學試驗報道，與本試驗研制的制劑試驗結(jié)果 有 差 異，經(jīng) 對 禿 瘡 花 制 劑 提 取 方 法［10，12，16－17］進行分析，認為禿瘡花制劑對小鼠的半數(shù)致死劑量的不同，應該是提取方法不同導致禿瘡花制劑中藥物成分和濃度不同而引起的。許多禿瘡花制劑的研制者用非特異手段如用活性碳吸附純化禿瘡花制劑，雖然安全性高，但藥物有效成分丟失也多，禿瘡花制劑質(zhì)量的提高，必須建立在確定禿瘡花藥物有效成分和其交互作用的基礎上才能有效地進行。

［1］暢行若，王宏新，周廣治，等.禿瘡花化學成分及組織形態(tài)研究［J］.藥物分析雜志，1982，2（5）：273－277.

［2］黨 巖，鞏鴻飛，柳軍璽，等.禿瘡花中提取的生物堿［J］.中國化學快報：英文版，2009，20（10）：1218－1220.

［3］盧賢昭，王 勤，王廷璞.紅茂草新藥資源開發(fā)應用基礎研究與臨床療效觀察［D］.甘肅蘭州：甘肅省科學技術(shù)廳，2005.

［4］陳正山，王 勤，王廷璞，等.禿瘡花注射液對小鼠腹腔巨噬細胞免疫功能的影響［J］.上海免疫學雜志，2001，21（4）：216－218.

［5］黨 巖，孫春香，茍想珍，等.疫苗和禿瘡花制劑對羊傳染性膿皰皮炎的防治效果［J］.當代畜牧，2008，174（10），17－18.

［6］龔艷妮，苗瑞東，王廷璞，等.紅茂草對荷瘤小鼠免疫功能的影響［J］.蘭州大學學報：醫(yī)學版，2008，34（3）：48－52.

［7］張興旺，何莉莉，王 勤.紅荗草注射液對免疫低下小鼠免疫功能的影響［J］.蘭州大學學報：自然科學版，2006，42（6）：55－57.

［8］趙 祁，韓 寅，杜宇平，等.禿瘡花提取物對紅細胞氧化性溶血的抑制機制［J］.蘭州大學學報：醫(yī)學版，2006，32（3）：40－45.

［9］趙 強，王廷璞，余四九，等.紅茂草生物堿抑菌活性的測定［J］.中國獸醫(yī)科學，2008，38（12）：1098－1101.

［10］趙 強.紅茂草生物堿有效成分分析及抑菌活性研究［D］.甘肅蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，2009.

［11］董曉寧，趙 強，楊 明.禿瘡花生物堿的提取與體外抑菌研究［J］.中獸醫(yī)學雜志，2010，153（2）：6－11.

［12］尹建華.一種治療羊傳染性膿皰病毒的擦劑及其制備方法［P］.中國專利：101606985，2009－12－23.

［13］茍想珍，黨 巖，馬志宏，孫春香，等.凱氏定氮法測定紅茂草提取物中的氮含量［J］.甘肅畜牧獸醫(yī)，2009，39（6），9－10.

［14］GB／衛(wèi)監(jiān)督發(fā)272號－2005，化學品毒性鑒定技術(shù)規(guī)范［M］.（2005：35－52.）

［15］殷 震，劉景華.動物病毒學 ［M］.北京：科技出版社，1997：329.

［16］陳 荃，王廷璞，趙蘭蘭，等.紅茂草藥理作用與人工栽培技術(shù)研究進展［J］.天水師范學院學報，2008，28（2）：49－51.

［17］王廷璞，安建平，賈志國，等.紅茂草生物堿提取方法及指紋檢測技術(shù)建立的研究［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2008，27（6）：41－44.