孫 裴，李 郁，魏建忠，王桂軍，楊 勇

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥，230036；2.安徽安泰農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司，安徽合肥 230036）

近年來，隨著我國(guó)規(guī)?；⒓s化養(yǎng)豬程度的不 斷提升，限飼養(yǎng)殖模式的廣泛應(yīng)用，絕大多數(shù)地區(qū)養(yǎng)豬的生產(chǎn)結(jié)構(gòu)發(fā)生了實(shí)質(zhì)性的變化，豬群密度過大。在封閉的環(huán)境中，飼養(yǎng)密度過大容易導(dǎo)致由空氣傳播的病原在豬群中和豬群間傳播［1］。現(xiàn)在普遍認(rèn)為呼吸系統(tǒng)疾病是現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中最嚴(yán)重的問題［2］。安徽省是養(yǎng)豬大省，豬呼吸道疾病是目前困擾其養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一。所有重要的呼吸系統(tǒng)疾病均有病原微生物的參與，實(shí)際上對(duì)豬只進(jìn)行病原微生物的隔離是非常困難的，有效的防控應(yīng)該是針對(duì)主要病原進(jìn)行預(yù)防與控制［3］。本研究以我國(guó)近年報(bào)道引起豬呼吸道疾病主要病原種類為基礎(chǔ)［4］，對(duì)安徽省2010年－2011年豬呼吸道疾病傳染性疾病病原，豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome viris，PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV－2）、豬鏈球菌（Streptococcussuis，SS）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida，Pm）、副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis，Hp）進(jìn)行了分離鑒定，為今后安徽省豬呼吸道疾病的防制策略制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 病料來源 無菌采集2010年－2011年安徽省皖南、皖中、皖北3個(gè)地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)具有典型呼吸道癥狀的病、死亡豬只的肺臟與肺門淋巴結(jié)及脾臟，共計(jì)180份病料，其中皖南采集73份、皖中采集65份、皖北采集42份。

1.1.2 陽性毒（菌）株 豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典毒株、豬繁殖與呼吸綜合征病毒缺失株、圓環(huán)病毒2型、巴氏桿菌、鏈球菌、副豬嗜血桿菌，均為安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定與保存［5－10］。

1.1.3 主要試劑 DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒均為北京天根生物公司產(chǎn)品；各種PCR及RTPCR反應(yīng)酶為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；血平板、輔酶平板購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)［6－10］所報(bào)道的引物，利用Primer5.0軟件分別進(jìn)行各菌（毒）株特異性引物的設(shè)計(jì)，并將鏈球菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌的單一PCR引物優(yōu)化后形成三重PCR引物。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。其中PRRSV經(jīng)典毒株與缺失毒株產(chǎn)物大小分別為650bp、567bp。

表1 各菌（毒）株P(guān)CR擴(kuò)增引物序列及擴(kuò)增片段大小Table 1 PCR amplification primers and amplified fragment sizes of each bacteria（viruses）strains

1.2.2 細(xì)菌的分離與PCR鑒定 利用血平板、輔酶平板，無菌操作對(duì)采集的肺臟和脾臟做細(xì)菌分離鑒定［6，8］，分離到細(xì)菌后通過染色鏡鑒，鑒定細(xì)菌形態(tài)后，對(duì)革蘭陰性菌分別進(jìn)行巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌的PCR鑒定。對(duì)革蘭陽性球菌或球桿菌進(jìn)行鏈球菌PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為：總體積25μL，其中5μL DNA模板（1pm／μL），15μL Mix（TaqE＋dNTP），5μL去離子水；PCR反應(yīng)條件為：95℃，10min；95℃1min，72℃50s，55℃45s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

1.2.3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測(cè) 將采集的肺臟與肺門淋巴結(jié)樣品，按照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行處理，用RT－PCR試劑盒提取總RNA，利用豬繁殖與呼吸綜合征病毒特異性引物，進(jìn)行RT－PCR的檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為：總體積25μL，其中5μL DNA模板（1pmol／μL），15μL Mix（TaqE＋dNTP），去離子水5μL；PCR 反應(yīng)條件為：95℃，10min；95℃1min，72℃ 45s，50℃ 45s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用10g／L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳觀察目的條帶。設(shè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典株與缺失株作為陽性對(duì)照，豬繁殖與呼吸綜合征病毒陰性病料作為陰性對(duì)照。

1.2.4 豬圓環(huán)病毒2型的檢測(cè) 將采集的肺門淋巴結(jié)與脾臟樣品，按照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行處理，利用PCV－2特異性引物，進(jìn)行PCR的檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為：總體積25μL，其中5μL DNA模板（1 pmol／μL），15μL Mix（TaqE＋dNTP），5μL去離子水；PCR反應(yīng)條件為：95℃10min；95℃1min，72℃40s，49℃50s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用10g／L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳與拍攝觀察目的條帶。設(shè)PCV－2細(xì)胞毒作為陽性對(duì)照，PCV－2陰性病料作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離與PCR鑒定結(jié)果

180份病料細(xì)菌分離與PCR鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，安徽省鏈球菌分離率可達(dá)22.8%，巴氏桿菌分離率5%，副豬嗜血桿菌分離率2.8%。其他細(xì)菌單重或混合感染率為15.6%，其中又以大腸埃希菌分離率最高（表2）。豬鏈球菌、巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的三重PCR結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示，SS／Hp／Pm特異性引物分別能夠從對(duì)應(yīng)的陽性病料中擴(kuò)增出片段大小與預(yù)期片段大小的產(chǎn)物，產(chǎn)物大小分別為294、822、457bp。

2.2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒與PCV－2檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)RT－PCR對(duì)180份病料檢測(cè)結(jié)果顯示，PRRSV缺失株與PCV－2感染率分別達(dá)到68.0%、83.3%（表3）。PRRSV 經(jīng)典株、缺失株與 PCV－2的PCR電泳圖顯示（圖1），PRRSV經(jīng)典株、缺失株與PCV－2的特異性引物分別能夠從對(duì)應(yīng)的陽性病料中擴(kuò)增出片段大小與預(yù)期片段大小的產(chǎn)物，產(chǎn)物大小分別為294、822、457bp。

表2 安徽省3個(gè)地區(qū)各種細(xì)菌檢出率Table 2 The detection rate of bacterial isolates in Anhui three regions %

表3 安徽省3個(gè)地區(qū)各種病毒檢出率Table 3 Virus isolation rate in Anhui three regions %

圖1 各種病原PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products of each pathogen

3 討論

豬呼吸道疾病成為養(yǎng)豬業(yè)和獸醫(yī)診療人員在臨床上很棘手的問題之一，發(fā)病率通常在30%～60%，死亡率7%～30%。臨床上從母豬、哺乳仔豬、保育豬和育肥豬等各個(gè)階段經(jīng)常發(fā)生呼吸道疾?。?－3］。安徽省皖南、皖中、皖北地區(qū)所采集的180份具有典型呼吸道疾病為特征的病豬病在臨床上的癥狀表現(xiàn)主要會(huì)出現(xiàn)結(jié)膜炎、淚斑或淚痕，發(fā)熱、氣喘、咳嗽、生長(zhǎng)緩慢，消瘦衰竭，死亡率升高［6－10］。飼養(yǎng)管理低下、重要病毒性疫苗免疫失敗、診療處置不當(dāng)、敏感藥物選擇不正確，甚至亂用抗菌素等因素是導(dǎo)致發(fā)病率、病死率進(jìn)一步升高，病程加長(zhǎng)的重要因素。目前豬呼吸道疾病多數(shù)不是單一某一個(gè)病因而形成的，而是一類多病原繼發(fā)、誘發(fā)、交叉或混合感染，根據(jù)感染類型可分為，一是原發(fā)性病原感染，包括豬肺炎支原體、PRRSV、PCV－2、豬偽狂犬病病毒、豬流感病毒、豬瘟病毒、豬巨細(xì)胞病毒、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬支氣管敗血波氏桿菌，二是繼發(fā)性感染病原體，包括有副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌、豬沙門菌等［11－17］。病料檢測(cè)結(jié)果顯示，PRRSV與PCV－2的高感染率是安徽省豬呼吸道疾病的重要原發(fā)性病原，鏈球菌等細(xì)菌的繼發(fā)感染是導(dǎo)致豬呼吸道癥狀進(jìn)一步加重的重要病因。本研究提示，安徽省規(guī)?；i場(chǎng)需要著重加強(qiáng)PRRS的綜合防控，豬圓環(huán)病毒疫苗的免疫，及防治細(xì)菌繼發(fā)感染的合理用藥及環(huán)境衛(wèi)生控制工作，以減少豬群呼吸道疾病在豬群中的流行與蔓延。

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