何 穎,趙 武*,秦毅斌,賴勝基,胡庭俊,梁保忠,李 斌,陳忠偉,胡 旭,金 鋒*,孫志勇,韋明宇,張恒博,藍炳順
近年來,以抗生素、激素等為主的飼料藥物添加劑的廣泛應用,為養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟效益的同時,耐藥菌株的產(chǎn)生、抗生素殘留等問題也給養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展、人類食品安全和生物生存環(huán)境造成了嚴重危害[1]。因此,開發(fā)和推廣既能有效替代抗生素、激素,又能有效地保健、防疫、促生長的新型綠色飼料添加劑已成為當務之急,而益生菌就是其中的研究熱點之一[2]。中國科學院心理研究所行為生物學研究室和廣西獸醫(yī)研究所針對不同宿主動物篩選出最為適合的菌株與合理有效的菌株組合方式,開發(fā)出包含了高密度發(fā)酵乳桿菌、瑞士乳桿菌、地衣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌等高密度活菌,以及多種酵母菌提取物的NS系列復合乳酸菌制劑。該產(chǎn)品涵蓋了動物飼養(yǎng)中所需的有益微生物菌群和促進其他菌群生長的因子,對保持動物良好精神狀態(tài),維持腸道正常菌群,對抗感染和刺激免疫系統(tǒng)有良好效果。本研究將該微生物制劑應用于養(yǎng)豬臨床,觀察該制劑對斷奶仔豬機體免疫水平的影響,為其進行推廣應用奠定理論基礎,同時也為減少抗生素在飼料中的應用開拓思路,更好地為生產(chǎn)實踐提供指導。
1.1.1 試驗用動物 選用20日齡斷奶,平均體重8.99kg±1.60kg的(杜/長)二元雜交仔豬90頭。仔豬于3日齡滴鼻免疫接種勃林格公司的偽狂犬gE基因缺失弱毒苗疫苗,于14日齡頸部肌肉注射免疫廣西生物制品廠的豬瘟細胞凍干疫苗。
1.1.2 NS復合乳酸菌制劑 該制劑中含發(fā)酵乳桿菌(109)、瑞士乳桿菌(108)和地衣芽胞桿菌(105)、枯草芽胞桿菌(105)、酵母菌提取物(108)。
1.1.3 藥物 金霉素(100mg/kg)和支原凈(含量450mg/g)為上海某動物保健公司生產(chǎn),批號100619、100607;阿莫西林(含量870mg/g)為珠海某企業(yè)有限公司生產(chǎn),批號1008304033。
1.1.4 基礎日糧 基礎日糧的配比如下表1所示。
1.1.5 主要試劑 IgA、IgG、IgM 和 TNF-γ進口分裝ELISA檢測試劑盒為上海江萊生物科技有限公司產(chǎn)品;豬瘟病毒抗體ELISA檢測試劑盒為美國IDEXX公司產(chǎn)品;豬偽狂犬病病毒抗體ELISA檢測試劑盒為武漢科前動物生物制品有限責任公司產(chǎn)品;流式細胞儀檢測使用的鼠抗豬Mouse Anti-Porcine CD3e-SPRD 單 抗 (CatNo:4510-10;0.5mg/mL)、Mouse Anti-Porcine CD8a-PE 單抗 (CatNo:4520-03;0.1mg/mL)和 Mouse Anti-Porcine CD4a-FITC單抗(CatNo:4515-02;0.5mg/mL)均為美國Southern Biotech公司產(chǎn)品;Opti Cycle C溶血素為美國BD公司產(chǎn)品;PBS緩沖液。
表1 基礎日糧的組成及營養(yǎng)水平Table1 Composition and nutrient level of basal diet
1.2.1 試驗用動物的管理與分組 飼養(yǎng)欄舍為封閉、漏縫地板式豬舍,豬自由采食,自動飲水器供水,豬進欄后用分組飼料按照常規(guī)飼養(yǎng)操作規(guī)程進行飼喂。90頭二元雜交斷奶仔豬隨機分為3個處理,每處理設3個重復,每重復10頭豬。3個處理組分別為A組、B組和C組。A組為對照組,飼喂基礎日糧配方,其營養(yǎng)水平見表1;B組為NS復合乳酸菌組,添加2g/kg NS復合乳酸菌制劑到基礎日糧中;C組為抗生素組,添加2g/kg金霉素、0.25g/kg阿莫西林和0.125g/kg的支原凈到基礎飼糧中。試驗期觀察30d。
1.2.2 采血 試驗第0、15、30天(仔豬28、43、58日齡),從每重復取3頭仔豬前腔靜脈采血5mL(每組共9頭),分為2份,其中1份約3mL,于37℃放置30min,然后低速離心以分離血清,置于-20℃冰箱保存,留待體液免疫指標、和豬瘟病毒、偽狂犬病毒抗體的測定;另1份采集2mL,迅速放入加有EDTA-K2的滅菌抗凝管中,輕輕混勻,置冰盒中運送到實驗室,保存于4℃冰箱,第2天進行T淋巴細胞亞群的檢測,放置時間不超過24h。
1.2.3 血 清 ELISA 檢 測 IgA、IgG、IgM 和TNF-γ的測定按照上海江萊生物科技有限公司的進口分裝ELISA檢測試劑盒操作說明進行。豬瘟病毒抗體檢測,按照美國IDEXX公司的豬瘟病毒抗體ELISA檢測試劑盒進行,判定標準:阻斷值<35為陰性,>40為陽性;偽狂犬病毒抗體,按照武漢科前動物生物制品有限責任公司偽狂犬病毒抗體ELISA檢測試劑盒說明書進行,判定標準:OD值≥0.476為陰性,OD值≤0.408為陽性。各組豬瘟病毒、偽狂犬病毒抗體陽性率計算:陽性率=各組陽性樣本數(shù)/各組檢測樣本總數(shù)。
1.2.4 T淋巴細胞亞群檢測 免疫熒光染色:取100μL全血,加入6μL以上流式細胞儀檢測使用的單克隆抗體(每種2μL),室溫避光孵育20min,加入1×溶血素2mL,室溫避光孵育8min,1 200 r/min離心5min,棄上清液,加入2mL磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 為7.4),1 000r/min離心5min,棄上清液,加入500μL PBS后,4h內(nèi)流式細胞儀(美國BD,型號:FACSCalibur)分析。
1.2.5 數(shù)據(jù)處理 用SPSS17.0軟件進行單因素方差統(tǒng)計分析,用Duncan's法進行最小顯著性檢驗,取α=0.05,結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示。
由表2可以看出,30dC組的IgA與0dC組相比降低了28.8%,差異顯著(P<0.05);30dB組的IgM與30dA組的相比高19.7%,與0dB組相比高28.8%,差異顯著(P<0.05);30dB組的IFN與30dA組的相比高10.2%,差異顯著(P<0.05)。豬瘟病毒抗體陽性率A組隨著仔豬日齡的增長不斷下降,而B組不斷升高,30dB組與30d A組相比陽性率高33.3%,差異顯著(P<0.05)。偽狂犬病毒抗體C組陽性率試驗15d時與0d相比下降了55.6%,與15dA組相比低33.4%;差異極顯著(P<0.01);30d時與0d相比下降了66.7%,與30dA組相比低55.6%,與30dB組相比低44.5%,差異極顯著(P<0.01)。
表2 各組斷奶仔豬體液免疫指標和豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒抗體水平的變化Table 2 The changes of humoral immunity indexes and CSFV,PRV antibody levels in weaning piglets of each group
由表3可以看出,隨著日齡的增加CD4+T細胞亞群的百分比不斷降低,A組15d比0d下降了14.6%,差異顯著(P<0.05),A組30d比0d降低了23.0%,30dC組比0dC組下降了24.3%,差異極顯著(P<0.01),30dC組與30dB組相比低18.1%,差異顯著(P<0.05);與CD4+T細胞亞群相反,CD8+T細胞亞群的百分比隨著日齡的不斷增加而上升,A組30d比0d上升了143.0%,C組30 d比0d提高了175.7%,差異極顯著(P<0.01),B組30d比0d提高了78.8%,差異顯著(P<0.05),30dC組與30dB組相比,CD8+T細胞的百分比高出79.2%,差異顯著(P<0.05)。本試驗中,隨著CD4+T細胞的百分比降低而CD8+T細胞的百分比升高,CD4+/CD8+的比值相應降低,A組30d比0d降低了2.75,B組30d比0d下降了2.24,C組30d比0d降低了3.04,差異極顯著(P<0.01)。
表3 不同處理對斷奶仔豬T淋巴細胞亞群的影響Table 3 Effect of defferent treatments on T lymphocyte subpopulations in weaning piglets
體液免疫是由骨髓來源的B淋巴細胞所產(chǎn)生的免疫球蛋白所介導的,可分為IgG、IgM、IgA、IgE、IgD共5類。其中IgG是血清中最主要的一種免疫球蛋白,能活化補體清除病原體。IgA分為血清型和分泌型IgA,對機體呼吸道、消化道等局部黏膜免疫具有抗感染作用[3]。本試驗中,由于試驗的對象為剛斷奶的仔豬,斷奶前母源IgG由初乳進入仔豬血液循環(huán)提供體液免疫,而分娩3d后母乳的主要免疫球蛋白IgA中的SIgA黏附在腸道黏膜,負責局部免疫,因此,切斷母乳獲得途徑后仔豬體內(nèi)的IgA和IgG隨著日齡的增長有不同程度的降低,這與李樹明等[4]有關仔豬血清抗體水平與乳源抗體含量呈正相關的研究結(jié)果是一致的。乳酸菌等有益菌占據(jù)動物消化道的大部分定植位點,從而作為免疫系統(tǒng)的佐劑,能夠增強腸黏膜的局部免疫防御反應[5]。飼喂復合乳酸菌15d時,復合乳酸菌等益生菌黏附在腸上皮細胞上誘導黏膜免疫應答,B組的IgA略有升高;而抗生素組30d的IgA與0d的相比顯著降低了28.8%,這可能與抗生素的使用破壞了仔豬胃腸道的微生物區(qū)系平衡,造成仔豬黏膜免疫功能下降,IgA分泌減少有關。本試驗中,相對IgA和IgG的下降,30dNS復合乳酸菌組的IgM與0d相比顯著升高了28.8%,與30dA組相比除了IgM 提高19.7%,INF-γ上升了10.2%,差異顯著。IgM是初次免疫應答最早產(chǎn)生的主要免疫球蛋白,能及時與補體結(jié)合溶解病原體。干擾素INF-γ是主要的巨噬細胞活化因子,可直接促進T、B細胞分化和CTL成熟,刺激B細胞分泌抗體,從而增強機體免疫機能。本研究中,在斷奶后機體內(nèi)IgA和IgG的下降的情況下,使用NS復合乳酸菌能調(diào)節(jié)斷奶仔豬機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生較多在抗感染中起著“先鋒”作用的免疫球蛋白IgM和INF-γ,從而加強仔豬機體的體液免疫,這對于其隨后的抗病力非常重要,在一定程度上也可以減少仔豬腹瀉的發(fā)生[6-7]。
國內(nèi)外的相關研究報道認為益生菌與疫苗有協(xié)同作 用,是 當 前 的 研 究 熱 點[8]。Ogawa T 等[9]報道,產(chǎn)蛋母雞飼喂益生菌和葡聚糖,可有效提高母雞對ND疫苗和傳染性支氣管炎疫苗的體液免疫反應。岑路等[10]發(fā)現(xiàn)益生菌和口蹄疫疫苗聯(lián)用后,益生菌具有顯著的防治口蹄疫和提高口蹄疫疫苗保護的作用。本試驗對斷奶仔豬使用NS復合乳酸菌和抗生素,研究其對斷奶仔豬豬瘟、偽狂犬疫苗免疫后抗體水平的影響,結(jié)果表明,NS復合乳酸菌的攝入,使得這兩種疫苗的抗體水平維持在一個較高的滴度,從而證明在基礎日糧中添加NS復合乳酸菌,能顯著促進斷奶仔豬的特異性免疫機能。對于益生菌可以調(diào)節(jié)一些抗體水平的機理,有研究表明益生菌可以啟動Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)防御功能中的重要信息傳遞,從而對損傷作出反應,啟動修復過程或通過干擾與TLR發(fā)生相互作用的其他細菌和宿主腸道表皮細胞上的TLR,進而調(diào)節(jié)一些抗體的水平[11-12]。
CD3存在于所有成熟T淋巴細胞表面,是鑒定和區(qū)別T淋巴細胞的主要標志;CD4主要是誘導性和輔助性T細胞,具有誘導細胞免疫和輔助B淋巴細胞合成IgG等免疫球蛋白的功能;CD8表達于大多數(shù)胸腺細胞及一部分外周T細胞上,主要是能特異性殺傷帶有抗原標記的細胞毒性T細胞和抑制性T淋巴細胞[13]。本研究中各試驗階段各組斷奶仔豬的CD3+T細胞亞群百分比無顯著變化,而隨著日齡的增加,CD4+T細胞亞群百分比顯著降低,CD8+T細胞亞群百分比顯著上升。這可能由于試驗0d時,仔豬體內(nèi)還有較高的母源抗體,CD4+/CD8+比值達到4以上,CD4處于高表達狀態(tài),這些輔助性T細胞誘導B細胞活化,輔助其分泌產(chǎn)生更多的免疫球蛋白IgA和IgG。仔豬斷奶后母源抗體的減少而之前過量抗體的表達隨后誘導了T淋巴細胞的免疫抑制作用,其中最主要的是CD8+T淋巴細胞的抑制細胞的增加,直接抑制了SIgA的合成[14],從而導致試驗后期,仔豬體內(nèi)IgA和IgG的合成減少,CD4+T細胞亞群百分比降低而CD8+T細胞亞群百分比升高,通過負反饋作用對機體的免疫狀態(tài)進行調(diào)節(jié),使CD4+/CD8+比值恢復到正常值2左右。這與一些研究表明外周CD+8T細胞比例隨年齡增大而增加的結(jié)果相一致[15]。從試驗結(jié)果看,NS復合乳酸菌組與抗生素組合A組相比,CD4+T細胞亞群含量沒有顯著下降,CD4+/CD8+比值維持在正常值2的范圍內(nèi),說明其對T淋巴細胞亞群的調(diào)控效果較好,能使機體處于較好的免疫狀態(tài)。
在早期斷奶仔豬飼料中添加復合乳酸桿菌不僅能夠有效地提高斷奶仔豬機體血清中的IgM含量和干擾素INF-γ的含量,從而增強仔豬的體液免疫功能,提高和維持豬瘟、偽狂犬免疫仔豬的抗體水平,并且能夠增加仔豬外周血T細胞CD8+亞群的比例,調(diào)節(jié)CD4+/CD8+亞群的比值,對仔豬的細胞免疫功能也有較好的增強和調(diào)節(jié)作用。
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