劉明明，賈立軍，薛書(shū)江，梁晚?xiàng)鳎瑥埵匕l(fā)

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉 133002）

豬附紅細(xì)胞體病是由豬附紅細(xì)胞體（Eperythrozoonsuis，E.suis）寄生于豬紅細(xì)胞表面、游離于血漿及骨髓中而引起仔豬發(fā)熱、貧血、黃疸，育肥豬生長(zhǎng)遲緩，母豬不孕、流產(chǎn)等癥狀為特征的人獸共患?。?－5］。目前針對(duì)豬附紅細(xì)胞體病的診斷，主要有病原體血液涂片染色鏡檢、血清學(xué)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complement fixation test，CFT）、間接血凝試驗(yàn)（indirect hemagglutination test，IHA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）等抗體檢測(cè)以及聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）［6－7］。但血液涂片染色鏡檢常常受到血液里不明微生物、染料顆粒和非病原性物質(zhì)等因素的干擾［8］；血清學(xué)方法存在抗原純度低、來(lái)源不足等缺點(diǎn)；PCR方法均是以16SrRNA的基因序列來(lái)建立，由于各種原核生物之間16SrRNA同源性較高，而擴(kuò)增序列又多為保守性強(qiáng)的區(qū)域，因此建立的PCR方法特異性不強(qiáng)。本試驗(yàn)根據(jù)GenBank上最新發(fā)布的豬附紅細(xì)胞體基因組序列（NC－015155）設(shè)計(jì)引物［9］，建立50S核糖體基因PCR檢測(cè)方法，以期為豬附紅細(xì)胞體的檢測(cè)提供更為敏感、特異的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性、陰性血液由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室鑒定、保存；45份血液樣本采自吉林省延邊地區(qū)某養(yǎng)豬場(chǎng)，頸靜脈無(wú)菌采集抗凝血，置－20℃保存，備用。

1.1.2 主要試劑 pMD18－T 載體、rTaqDNA 聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶SalI和EcoR I、DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；X－gal、LB培養(yǎng)基、大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 豬附紅細(xì)胞體基因組DNA提取 按照全血基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中發(fā)布的豬附紅細(xì)胞體基因組序列Illinois（NC＿015155），應(yīng)用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引物 P1：5′－TGGAGTTACTGGAGGTTCA－3′， 下 游 引 物 P2： 5′－GGTGGAGAAAATAAGAGTTGAG－3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及最佳退火溫度的篩選 PCR反應(yīng)在25μL體系中進(jìn)行，包括10×buffer 2.5μL，dNTP 2μL，TaqDNA Polymerase 0.3μL，上下游引物 （10pmol／L）各 1.5μL，DNA 模板 2μL，ddH2O補(bǔ)到25μL。擴(kuò)增程序：95℃5min；94℃50 s，49.8℃～60.7℃退火50s，72℃延伸80s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的回收與克隆 取PCR產(chǎn)物10 μL，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA回收試劑盒回收目的條帶，回收產(chǎn)物連接到pMD18－T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，將其涂布于含有IPTG和X－Gal的氨芐LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.5 重組質(zhì)粒的鑒定、測(cè)序分析 經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行SalI和EcoRI雙酶切鑒定及PCR鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。將測(cè)得核苷酸序列與GenBank中豬附紅細(xì)胞體基因組進(jìn)行同源性比較。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 豬源大腸埃希菌、豬鏈球菌、豬肺炎支原體、牛附紅細(xì)胞體的基因組DNA均由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。按照最佳退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.2.7 敏感性試驗(yàn) 提取豬附紅細(xì)胞體血液基因組DNA，測(cè)定其OD260nm值，將模板DNA按1∶10比例連續(xù)稀釋后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以此來(lái)確定PCR方法的敏感性。

1.2.8 臨床樣本的檢測(cè) 以建立的PCR方法對(duì)采自吉林省延邊地區(qū)的45份疑似豬附紅細(xì)胞體感染的血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行姬姆薩染色鏡檢，比較兩者的陽(yáng)性檢出率。

2 結(jié)果

2.1 豬附紅細(xì)胞體的PCR擴(kuò)增

以豬附紅細(xì)胞體感染的陽(yáng)性血液提取的基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出了大小為1 100bp左右的DNA片段。

2.2 PCR最佳退火溫度的篩選

以豬附紅細(xì)胞體感染的陽(yáng)性血液提取的基因組DNA為模板，應(yīng)用上述的PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行溫度梯度PCR擴(kuò)增，篩選最佳的退火溫度。結(jié)果表明，在57℃時(shí)擴(kuò)增出的目的條帶最為清晰明亮。因此以57℃為最佳退火溫度（圖1）。

2.3 目的基因的克隆及重組質(zhì)粒的鑒定

將回收的目的片段克隆到pMD18－T vector載體上，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和限制性?xún)?nèi)切酶SalI、EcoR I的雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)與預(yù)期大小相符條帶（圖2）。

2.4 序列分析

將測(cè)序得到的豬附紅細(xì)胞體基因核苷酸序列與GenBank中豬附紅細(xì)胞體基因組Illinois（NC＿015155）和KI＿3806（NC＿015153）序列進(jìn)行同源性比較，其中與模板序列Illinois型的同源性為93%，測(cè)序結(jié)果已上傳至NCBI（登錄號(hào)JN166805）。而KI＿3806致病型的引物擴(kuò)增區(qū)間內(nèi)存在大小為129 bp的片段缺失，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為970bp，這也正符合試驗(yàn)的最初設(shè)計(jì)，通過(guò)PCR擴(kuò)增后得到的片段大小，來(lái)區(qū)分病豬被哪種致病型的病原體所感染，測(cè)得序列的BLAST結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 溫度梯度PCR結(jié)果Fig.1 Temperature gradient PCR results

圖2 重組質(zhì)粒PCR鑒定和酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by PCR and enzyme digestion

圖3 序列同源性分析Fig.3 The analysis of sequence homology

2.5 特異性試驗(yàn)

分別以豬附紅細(xì)胞體、豬源大腸埃希菌、豬鏈球菌、豬肺炎支原體、牛附紅細(xì)胞體及健康豬血液的基因組DNA為模板，在已建立的擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，只有豬附紅細(xì)胞體DNA模板擴(kuò)增出目的條帶，表明建立的PCR方法具有較好的特異性（圖4）。

圖4 特異性試驗(yàn)Fig.4 The specificity test of PCR

2.6 敏感性試驗(yàn)

取豬附紅細(xì)胞體標(biāo)準(zhǔn)品DNA（經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)得其含量為190ng／μL）按10倍倍比稀釋后，用上述PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明該反應(yīng)體系檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)模板DNA的最大稀釋倍數(shù)為1×107，DNA最低檢測(cè)量為19fg／μL（圖5）。

2.7 臨床樣品的檢測(cè)

用建立的PCR方法對(duì)采自吉林省延邊地區(qū)的45份疑似豬附紅細(xì)胞體感染的血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行姬姆薩染色鏡檢。結(jié)果PCR檢測(cè)出38份陽(yáng)性樣本，而姬姆薩染色鏡檢則檢測(cè)出32份陽(yáng)性樣本，其中姬姆薩染色鏡檢為陽(yáng)性的32份樣本PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6和表1。

圖5 敏感性試驗(yàn)Fig.5 The sensitivity results of PCR

圖6 PCR檢測(cè)部分臨床樣本Fig.6 The detection of some clinical samples by PCR

表1 PCR和姬姆薩染色鏡檢對(duì)45份豬血液樣本的檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of PCR and Giemsa staining for pig blood from 45samples

3 討論

目前，針對(duì)附紅細(xì)胞體病建立的PCR診斷方法均是以16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)引物，16SrRNA屬于30S核糖體亞基，而附紅細(xì)胞體16SrRNA的種間同源性較高，導(dǎo)致對(duì)豬附紅細(xì)胞體病的檢測(cè)存在一定誤差［10－12］。因此，本試驗(yàn)根據(jù)50S核糖體亞基基因序列設(shè)計(jì)引物建立PCR診斷方法，取得了預(yù)期的結(jié)果。該方法陽(yáng)性檢出率為86.7%，明顯高于姬姆薩染色鏡檢法的71.1%，而且姬姆薩染色鏡檢為陽(yáng)性的32份樣本PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性，說(shuō)明建立的PCR檢測(cè)方法具有特異、敏感、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，完全適用于豬附紅細(xì)胞體病的診斷。

本試驗(yàn)在設(shè)計(jì)引物時(shí)，是根據(jù)GenBank中最新發(fā)布的2個(gè)豬附紅細(xì)胞體基因組序列KI－3806（NC－015153）和Illinois（NC－015155）的保守區(qū)域而設(shè)計(jì)［9，13－14］，該引物擴(kuò)增產(chǎn)物能夠區(qū)分豬附紅細(xì)胞體KI－3806和Illinois兩種致病型。其中在 KI－3806（NC－015153）致病型的引物擴(kuò)增區(qū)間內(nèi)存在129bp大小的片段缺失，預(yù)期擴(kuò)增 KI－3806（NC－015153）片段大小為970bp，擴(kuò)增Illinois（NC－015155）片段大小為1 099bp。遺憾的是本試驗(yàn)僅擴(kuò)增出了Illinois（NC－015155）致病型1 099bp的基因片段，這可能與采集樣本資源的地理區(qū)域局限性有關(guān)，在后續(xù)研究中將擴(kuò)大采集樣本的區(qū)域范圍，以進(jìn)一步完善該引物的應(yīng)用價(jià)值。

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