邢 瑩，賈立軍，張守發(fā)

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉 133002）

豬附紅細(xì)胞體病是由豬附紅細(xì)胞體（Eperythrozoon suis）寄生于豬紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓引起的一種人獸共患傳染?。?］。可發(fā)生于各種年齡的豬，但以仔豬和長勢好的架子豬死亡率較高，母豬的感染也比較嚴(yán)重?；疾∝i及隱性感染豬是重要的傳染源，但其傳播途徑和發(fā)病機(jī)理目前還不十分清楚。近年來，該病在我國多個(gè)地區(qū)流行，給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失且危害人類健康。因此，及時(shí)診斷和防治附紅細(xì)胞體病具有非常重要的意義［2］。

信號識別顆粒（signal recognition particle，SRP）是普遍存在于具有細(xì)胞形態(tài)的所有生物細(xì)胞質(zhì)中的一種由 RNA和蛋白質(zhì)組成的核蛋白復(fù)合物［3－4］，但在葉綠體中除外［5］。SRP所共有的兩種基本成分為SRP54蛋白和SRP RNA，它的主要功能是通過SRP循環(huán)識別并結(jié)合核糖體上新生分泌性蛋白質(zhì)的信號肽序列，介導(dǎo)此類蛋白質(zhì)穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，被定向地運(yùn)輸?shù)襟w內(nèi)的合適部位［6－7］，即參與合成的初始蛋白的共翻譯過程［8］。本試驗(yàn)對豬附紅細(xì)胞體信號識別顆粒54基因進(jìn)行了克隆、生物信息學(xué)分析及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，以期為研究豬附紅細(xì)胞體尚未明了的蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)輸?shù)姆肿訖C(jī)制提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

豬血液樣本采自吉林省延邊地區(qū)某養(yǎng)豬場，經(jīng)PCR鑒定為感染附紅細(xì)胞體的全血，基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒、DNA純化回收試劑盒、Ex Taq DNA 聚合酶、pMD18－T simple載體、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；E.coli DH 5α、BL－21由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中發(fā)表的豬附紅細(xì)胞體全基因組序列（登錄號：NC＿015153.1）中的信號識別顆粒基因，應(yīng)用Primer Premie5.0軟件設(shè)計(jì)一對特異性引物，兩條引物5＇端分別加入BamHⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（下劃線部分），引 物 序 列 為 P1：5＇－CGCGGATCCATGCTTCTTTCAGGAATAATTC－3＇；P2：5＇－CCGCTCGAGTCACGCAGTGAATTCATTTTC－3＇。由上海英俊生物工程有限公司合成。

1.2.2 豬附紅細(xì)胞體DNA的提取及目的片段的擴(kuò)增 按照全血基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取豬附紅細(xì)胞體基因組DNA。以其為模板，采用25μL PCR反應(yīng)體系包括10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol／L dNTP 2 μL，DNA 模 板 2 μL，10 pmol／L的P1和P2各1.5μL，Ex Taq DNA聚合酶0.25μL，ddH2O 15.25μL。優(yōu)化的反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃50s，68℃50s，72℃1min 20s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸7min。10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、克隆及鑒定 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收后與pMD18－T simple載體4℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH 5α中，在涂有IPTG和X－gal的氨芐抗性平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落，按質(zhì)粒小量制備試劑盒說明提取重組陽性質(zhì)粒，經(jīng)PCR、雙酶切鑒定正確后送至Invitrogen公司進(jìn)行測序。

1.2.4 序列分析 利用 NCBI（http：／／ncbi.nlm.gov）進(jìn)行Blast比對、尋找開放閱讀框，ProtParam（http：／／www.expasy.ch／tools／protparam.html）進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)分析［9］，SOSUI WWW Server預(yù)測有無跨 膜 區(qū)，SMART（http：／／smart.embl－h(huán)eidelberg.de／）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。

1.2.5 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將重組克隆質(zhì)粒pMD18－T－SRP54、pGEX－4T－1 質(zhì) 粒 分 別 經(jīng) BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，將酶切的目的基因與載體按3∶1的體積混合，加入T4DNA連接酶4℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 BL－21中，方法同1.2.3，將 鑒 定 正 確 的 重 組 質(zhì) 粒 命 名 為 pGEXSRP54。

2 結(jié)果

2.1豬附紅細(xì)胞體信號識別顆粒54基因的克隆及鑒定

血樣DNA經(jīng)引物P1、P2擴(kuò)增得到1條1 164 bp的特異性條帶，與預(yù)期大小一致（圖1）。連接至克隆載體pMD18－T simple，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18－T－SRP。經(jīng)PCR及雙酶切鑒定，PCR獲得1 164bp的目的條帶（圖2），BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切獲得兩條目的條帶，大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖3）。

圖1 PCR擴(kuò)增的豬附紅細(xì)胞體SRP54基因Fig.1 PCR amplication of SRP54gene of E.suis

圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by PCR

圖3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 Identication of recombinant plasmid by enzyme digestion

圖4 表達(dá)質(zhì)粒pGEX－SRP54的PCR鑒定Fig.4 Identification of recombinant expression plasmid by PCR

圖5 表達(dá)質(zhì)粒pGEX－SRP54的酶切鑒定Fig.5 Identification of recombinant expression plasmid by enzyme digestion

2.2 序列分析

所克隆的豬附紅細(xì)胞體信號識別顆粒54基因，含有一個(gè)完整的ORF，編碼381個(gè)氨基酸，利用生物信息學(xué)對該基因進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)分析表明，該基因分子質(zhì)量約為43ku，等電點(diǎn)為6.51，此蛋白完全在膜內(nèi)，沒有跨膜區(qū)；二級結(jié)構(gòu)分析顯示，該基因包括201個(gè)α螺旋（helix）、42個(gè)β轉(zhuǎn)角（turn）和82個(gè)無規(guī)卷曲（coil）；結(jié)構(gòu)域分析表明，該基因編碼的氨基酸序列主要為G結(jié)構(gòu)域，具有GTP酶活性，其中包括N結(jié)構(gòu)域（SRP54＿N）和SRP兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。

2.3 表達(dá)質(zhì)粒pGEX－SRP54的鑒定

對重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX－SRP54用P1、P2引物進(jìn)行PCR鑒定獲得約1 164bp的目的條帶（圖4），同時(shí)用BamHⅠ和Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定獲得約4 900bp和1 164bp兩條目的條帶（圖5）。說明SRP54基因已成功連接到表達(dá)質(zhì)粒pGEX－4T－1上。

3 討論

SRP介導(dǎo)的蛋白識別轉(zhuǎn)運(yùn)途徑在生物界普遍存在，首先在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，作用機(jī)制已明確，而在原核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)較晚，作用機(jī)制還未完全揭示［10］。雖然SRP在進(jìn)化上高度保守，不同種系的SRP成分在結(jié)構(gòu)和功能上有很大的一致性［4，6］，但SRP體系在原核生物物種間有一定差別，預(yù)示著其機(jī)制既有統(tǒng)一性，又有物種特異性［10］。

SRP主要通過SRP54蛋白識別、結(jié)合信號肽序列參與新生蛋白質(zhì)的共翻譯易位，由此介導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜 定 向 運(yùn) 輸［4，7，11］，與此同 時(shí)，能 量 分 子 GTP 在SRP介導(dǎo)的蛋白識別轉(zhuǎn)運(yùn)過程中也發(fā)揮了重要的作用［12］。SRP54的本質(zhì)是GTP酶，其活性受SRP的其他組成成分影響，只有在形成復(fù)合物的情況下才能表現(xiàn)出強(qiáng)的GTP酶活性［10］，如果將其突變，則蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)將嚴(yán)重受阻，進(jìn)而影響到生物體的生命循環(huán)過程。

目前，在國內(nèi)人們對于豬附紅細(xì)胞體病的認(rèn)識還主要停留在臨床診斷層面上，對該病原體尚未進(jìn)行系統(tǒng)的分子生物學(xué)分析［13］，對于該病原體的特異DNA序列也存在異議。自2011年NCBI首次登錄豬附紅細(xì)胞體全基因組序列以來，許多基因片段的功能還有待于進(jìn)一步研究，本試驗(yàn)根據(jù)其中的信號識別顆粒（SRP）蛋白基因設(shè)計(jì)一對特異性引物，從自然感染豬附紅細(xì)胞體血液中擴(kuò)增出SRP54基因片段，對其編碼的蛋白進(jìn)行了預(yù)測分析，并構(gòu)建了該基因的表達(dá)載體。明確了克隆的豬附紅細(xì)胞體SRP54基因含有一個(gè)完整的ORF，編碼381個(gè)氨基酸，該基因表達(dá)蛋白的分子質(zhì)量為43ku，等電點(diǎn)為6.51，此蛋白完全在膜內(nèi)，沒有跨膜區(qū)；二級結(jié)構(gòu)分析顯示，該基因以α螺旋為主；結(jié)構(gòu)域分析顯示，該基因編碼的氨基酸序列主要為G結(jié)構(gòu)域，具有GTP酶活性，其中包括N結(jié)構(gòu)域（SRP54－N）和SRP兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。N結(jié)構(gòu)域和G結(jié)構(gòu)域主要參與GTP的結(jié)合和水解，Mg2＋對于NG結(jié)構(gòu)域發(fā)揮GTP酶活性是必需的，能幫助核苷酸的結(jié)合與解離；如果沒有Mg2＋的參與，G結(jié)構(gòu)域中核苷酸結(jié)合位點(diǎn)的保守側(cè)鏈相互作用形成緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而不能結(jié)合核苷酸［14］，在沒有核苷酸存在時(shí)，NG結(jié)構(gòu)域則易受蛋白酶降解［15］。因此，有必要對該基因進(jìn)行更深入的研究。

本試驗(yàn)所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒為下一步蛋白表達(dá)及其對豬附紅細(xì)胞體新生蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)輸?shù)难h(huán)功能的研究提供了基礎(chǔ)材料。

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