王海麗，葛長城，徐公義，趙德明

（1.聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院 聊城市畜禽疫病診療工程技術(shù)研究中心，山東聊城 252000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193）

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia）是由豬胸膜肺炎放線桿菌 （Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的一種急性或慢性以肺炎和胸膜炎為特征的傳染病。該病可以通過空氣或豬之間相互接觸而傳播，近年來發(fā)病率日益增高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一［1］。APP對(duì)患豬肺部防御系統(tǒng)的破壞，使此病往往與偽狂犬病、豬藍(lán)耳病等病毒性疾病混合或繼發(fā)感染，加大疾病的危害，造成更大的損失［2］。APP共有15種血清型，且各個(gè)國家流行的優(yōu)勢(shì)血清型各不相同［3］。不同血清型間及同一血清型不同菌株的毒力由多種因素決定，包括莢膜多糖、脂多糖、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白、脲酶和RTX毒素等［4］。

RTX（repeat in toxin，RTX）是多種革蘭陰性菌產(chǎn)生的一種外毒素，具有可使脂質(zhì)雙層膜形成通道的特性。不同血清型的APP分別表達(dá)不同的溶血素（hemolysins）和細(xì)胞毒素（cytotoxins），即 ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ，都屬于細(xì)胞孔形成毒素。前3種Apx毒素既是APP致病的主要毒力因子，又是APP主要的保護(hù)性抗原［5］。ApxⅠ具有典型的RTX毒素單元結(jié)構(gòu)特征，具有很強(qiáng)的溶血活性和細(xì)胞毒性，分子質(zhì)量為105ku，它對(duì)豬的肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞也具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，由毒力較強(qiáng)的血清1、5、9、10和11型表達(dá)并分泌［6］。ApxⅡ存在于除血清10型外的所有血清型。ApxⅢ被血清2、3、4、6、8、15型分泌；所有的血清型均能分泌ApxⅣ，據(jù)稱其只在體內(nèi)表達(dá)，在體外培養(yǎng)基中不能誘導(dǎo)其表達(dá)，故血清10型在體外培養(yǎng)只表達(dá)ApxⅠ［7］。ApxⅠ操縱子包括4個(gè)基因，分別為激活基因ApxⅠC、結(jié)構(gòu)毒素基因ApxⅠA和兩個(gè)分泌必需基因ApxⅠB和ApxⅠD。有證據(jù)顯示ApxⅠA基因是位于ApxⅠN端的疏水結(jié)構(gòu)，是ApxⅠ的主要抗原位點(diǎn)，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和保護(hù)性抗體［8］。

根據(jù)山 東 省 APP 血 清 型 特 點(diǎn)［9－10］，本 試 驗(yàn) 以APP血清10型標(biāo)準(zhǔn)菌株天然分泌的外毒素ApxⅠ為免疫原，以血清5型ApxⅠN端1 149bp基因克隆、表達(dá)的融合蛋白為篩選抗原，研制了抗ApxⅠA單克隆抗體mAb，并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞系及菌株 6周齡Balb／c純系小鼠，由上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（清潔級(jí)）；小鼠骨髓瘤細(xì)胞系（SP2／0）由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室保存并傳代；APP 3、5、7、10型標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬鏈球菌2型、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌等菌株為聊城市畜禽疫病診療工程技術(shù)研究中心保存。APP血清10型豬陽性血清由聊城市畜禽疫病診療工程技術(shù)研究中心制備。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640為Gibco公司產(chǎn)品；HAT、HT為Invitrogen公司產(chǎn)品；PEG 1500為Roche公司產(chǎn)品；羊抗小鼠IgG－HRP為Promega公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑為Gibco BRL公司產(chǎn)品；HAT、HT、Mab亞類鑒定試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的提取及純化 將血清10型APP接種于含0.2mL／L NAD、50mL／L 犢牛血清、1 mmol／L CaCl2的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h（180r／min），培養(yǎng)物于4℃5 000r／min離心30 min，收集上清液。將上清緩慢加入飽和硫酸銨至60%飽和度，4℃過夜，經(jīng)4℃以5 000r／min離心30 min，收集沉淀，并用10mmol／L Tris－HCl緩沖液（pH 7.4）溶解；通過4℃透析、超濾管濃縮、Sephadex G－200凝膠層析純化Apx I。層析液用紫外分光光度法及SDS－PAGE進(jìn)行濃度、純度的鑒定。

1.2.2 基因的克隆與測(cè)序 根據(jù)GenBank登錄的ApxⅠA基因序列（AF363361），設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物：上游引物：5′－CCGGAATTCGAAAATGGTTTGGGAC（劃線部分為引入的EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)）；下 游 引 物：5′－CCGGGATCCGAAGATTGCCTGTTTAG（劃線部分為引入的BamHⅠ酶切位點(diǎn)）。將PCR產(chǎn)物回收后克隆至載體pMD18－T中，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli BL21。通過限制性內(nèi)切酶篩選和鑒定陽性質(zhì)粒，并由上海博亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)定結(jié)果使用http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST 進(jìn)行同源性分 析，并應(yīng)用DNA Star軟件驗(yàn)證其閱讀框。

1.2.3 ApxⅠA原核表達(dá)載體的構(gòu)建 采用常規(guī)方法將ApxⅠA基因片段克隆至pET－32a載體中，并轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)酶切鑒定的陽性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.4 蛋白的表達(dá)、純化 選取高表達(dá)的pET－32a－apxⅠA重組體擴(kuò)大培養(yǎng)［11］，IPTG 誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。培養(yǎng)液離心后的沉淀用PBS（pH 7.4）洗兩遍。用1／10培養(yǎng)液的PBS重懸菌體，冰浴下超聲碎菌30min（工作30s，間隔30s），于4℃12 000r／min離心15min，收集沉淀，用等體積含20 g／L十二烷基肌氨酸鈉（SKL）的 PBS（pH 7.4）重懸，震振溶解，4℃下至包涵體充分溶解后10 000 r／min離心10min，將上清轉(zhuǎn)入透析袋并加入終濃度為2g／L的PEG 4 000和終濃度為50mmol／L的氧化型谷胱甘肽與100mmol／L的還原性谷胱甘肽，用PBS（pH 8.0）4℃透析3d，每天換3次，不斷攪拌。SDS－PAGE分析重組蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 抗原性鑒定 將純化的血清10型外毒素ApxⅠ蛋白及融合蛋白rApxⅠA進(jìn)行SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)化至硝酸纖維素膜上，以APP血清10型豬陽性血清為一抗，Western blot分析。

1.2.6 動(dòng)物免疫 用制備的天然毒素加等量弗氏完全佐劑乳化，分多點(diǎn)皮下注射3只Balb／c小鼠（30μg／只～50μg／只），14d后將適量抗原加等量弗氏不完全佐劑乳化，進(jìn)行第2次免疫，14d后第3次免疫。三免10d后，斷尾取血液1滴，測(cè)抗體效價(jià)。選滴度高的1只小鼠，用50μg天然毒素不加佐劑，腹腔注射加強(qiáng)免疫。3d～4d后，無菌取小鼠脾臟，制備免疫脾細(xì)胞懸液。

1.2.7 檢測(cè)方法的建立 采用方陣滴定法確定間接ELISA所用包被抗原和抗體的最適工作濃度。將Balb／c小鼠陽性血清和陰性血清均做倍比稀釋，確定最適工作濃度。

1.2.8 細(xì)胞融合和單克隆抗體的篩選 按文獻(xiàn)［12］方法制備免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2／0細(xì)胞，融合劑采用PEG 1 500。融合過程參考文獻(xiàn)［13］方法進(jìn)行。待融合細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔底面積的1／3～1／2時(shí)采用間接ELISA方法篩選。選擇分泌抗體效價(jià)高、呈單個(gè)克隆生長、形態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞繼續(xù)克隆3次以上，直至抗體分泌陽性率達(dá)100%為止，及時(shí)液氮凍存并制備單抗腹水。

1.2.9 單克隆抗體的特異性及穩(wěn)定性鑒定

（1）間接ELISA鑒定單抗的特異性 用豬鏈球菌2型、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌37℃震蕩培養(yǎng)后，離心收取上清中蛋白，方法同APP外毒素的制備方法，包被ELISA板。腹水的工作濃度為1∶1 000，以間接ELISA測(cè)定4H3和11B5mAb特異性。

（2）Western blot鑒定 豬鏈球菌2型、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌培養(yǎng)物，加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，分別離心收集菌體裂解后進(jìn)行SDS－PAGE電泳，然后用濕法將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，80 V 轉(zhuǎn)印1.5h，PBST洗膜3次，5min／次，腹水按一定濃度稀釋后作用于膜4℃過夜，洗膜同上。加入1∶10 000稀釋的羊抗鼠IgG－HRP，室溫?fù)u床上作用2h，洗膜3次，DAB顯色。

（3）雜交瘤分泌抗體的穩(wěn)定性 對(duì)鑒定的2株陽性ApxⅠ雜交瘤細(xì)胞，分別液氮中保存細(xì)胞株。另外部分細(xì)胞傳30代以上，以間接ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清。細(xì)胞凍存6個(gè)月后復(fù)蘇細(xì)胞，顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞活性。

（4）單克隆抗體亞型鑒定 按鼠類單克隆抗體亞類鑒定試劑盒說明書鑒定Ig亞類，以O(shè)D490nm值明顯高于其他孔者，所加亞類血清判斷為單抗亞類。

2 結(jié)果

2.1 Apx IA基因序列同源性分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載APP血清1型（AF240779、X52899、X68595、U05042）、血清5型（U04954、CP000569、AF363361）、血 清 9 型（X73ll7）、血清10型 （D16582）ApxI A 基因序列，與去除酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基的測(cè)序基因序列，進(jìn)行核核酸序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，同豬傳染性胸膜肺炎l、5、9、10型的 ApxI A基因同源性高達(dá)98.8%～100%。

2.2 ApxⅠA重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白的表達(dá)、純化

質(zhì)粒用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳顯示，觀察到約1 049bp的目的片段，表明成功地構(gòu)建了含ApxⅠA基因片段的重組表達(dá)質(zhì)粒（圖1）。SDS－PAGE顯示，誘導(dǎo)后的重組菌在分子質(zhì)量約41ku處有一清晰的新生條帶，純化后獲得了較為純的單一蛋白條帶（圖2）。

圖1 重組質(zhì)粒pET－32a－apxⅠA的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET－32a－apxⅠA by enzyme digestion

2.3 ApxⅠ天然外毒素的提取

獲得的天然外毒素，經(jīng)硫酸銨純化、濃縮后，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度為1.9mg／mL。Western blot檢測(cè)蛋白大小約105ku（圖3）。

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析Fig.2 SDS－PAGE analysis of fusion protein rApxⅠA

圖3 天然外毒素SDS－PAGE分析結(jié)果Fig.3 SDS－PAGE analysis of natural outer toxin

2.4 Western blot分析

Western blot的結(jié)果顯示，提取的APP天然外毒素ApxⅠ在相對(duì)分子質(zhì)量在105ku處與APP豬陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)條帶；原核表達(dá)的融合蛋白約在41ku處與APP豬陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)條帶，表明制備的融合蛋白具有特異性（圖4）。

2.5 雜交瘤細(xì)胞系的建立

細(xì)胞融合后5d觀察，細(xì)胞的融合率為100%，抗體檢測(cè)陽性率為51%。選擇其中4個(gè)抗體陽性的融合細(xì)胞孔細(xì)胞株進(jìn)行了3～5次克隆化，最終獲得細(xì)胞陽性率為100%，分泌穩(wěn)定、形態(tài)良好的細(xì)胞株共2株。

2.6 間接ELISA檢測(cè)單克隆抗體特異性

在490nm波長下，腹水與rApxⅠA蛋白、APP 10型作用數(shù)值，明顯高于APP 3型、APP 7型、豬鏈球菌2型、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌的數(shù)值（圖5），說明4H3、11B5兩株抗ApxⅠ單克隆抗體有良好的特異性。

圖4 蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of proteins

圖5 ApxⅠA mAb特異性檢測(cè)Fig.5 Specific detection of ApxⅠA mAb

2.7 Western blot鑒定單克隆抗體特異性

2株ApxⅠA單克隆抗體腹水與APP 3型、APP 7型、豬鏈球菌2型、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌的裂解液沒有反應(yīng)條帶，而與rApxⅠA、APP 10型分別在相對(duì)分子質(zhì)量約41ku和100ku處有棕色反應(yīng)條帶（圖6），表明2株單克隆抗體具有良好的反應(yīng)原性。

2.8 單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定

上述2株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體腹水效價(jià)在1∶104～1∶105；單克隆細(xì)胞株在培養(yǎng)24h且有很強(qiáng)的活力下，吸取培養(yǎng)上清進(jìn)行測(cè)定。上清中單抗效價(jià)為1∶256～1∶512之間（表1）。表明連續(xù)傳代的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清中抗體效價(jià)沒有降低。

圖6 Western blot鑒定mAb特異性Fig.6 Specific detection mAb by Western blot

2.9 雜交瘤細(xì)胞系的穩(wěn)定性

上述2株雜交瘤細(xì)胞體外傳30代后，間接ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中的mAb，其效價(jià)基本不變。保存于液氮中的雜交瘤細(xì)胞凍存6個(gè)月后其效價(jià)基本不變（表1），說明獲得的2株雜交瘤細(xì)胞系穩(wěn)定性好。

2.10 單克隆抗體的亞型鑒定

4H3mAb分子的亞類為IgG3；11B5mAb的分子亞類為IgG2a。

表1 單克隆抗體效價(jià)檢測(cè)Table 1 Detection titers of monoclonal antibodies

3 討論

APP溶血毒素Apx I分子質(zhì)量為105ku，是分泌到APP菌體外的一類外毒素，對(duì)豬的肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞也具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，由毒力較強(qiáng)的血清1、5、9、10和11型表達(dá)并分泌，其中APP血清10型包括ApxⅠ和ApxⅣ兩種Apx毒素，而體外培養(yǎng)中不會(huì)產(chǎn)生ApxⅣ毒素［14］。本研究的制備采用APP 10型標(biāo)準(zhǔn)株體外培養(yǎng)法獲取天然ApxⅠ蛋白。Apx I分泌量相對(duì)較少，受多種因素的影響。由于APP 10型是依賴NAD的Ⅰ型，低濃度NAD的培養(yǎng)條件能夠使APP分泌更多的毒素［15］，另外，培養(yǎng)液中游離的Ca2＋可影響ApxⅠ的分泌［16］，筆者在LB培養(yǎng)液中加入0.2g／L NAD和終濃度為1mmol／L的CaCl2，在此條件下培養(yǎng)12h時(shí)Apx I的分泌量達(dá)到最大。在Apx I純化時(shí)，將Sephadex G－200凝膠過濾層析、超濾管超濾同時(shí)進(jìn)行，由于超濾管具有濃縮作用，這樣較使用聚乙二醇濃縮既可以保證Apx I活性不會(huì)降低，而且也提高了樣品的純度及產(chǎn)量，滿足了研究的需要。

據(jù)報(bào)道，ApxⅠ的N－端蛋白免疫原性良好，可以抵抗特異性菌致死劑量的攻擊，對(duì)鼠可誘發(fā)保護(hù)性免疫，基本可以達(dá)到ApxⅠ的免疫效果。ApxⅠA位于ApxⅠ的N端，本研究構(gòu)建了APP pET－32aapxⅠA表達(dá)質(zhì)粒，可表達(dá)ApxⅠA融合蛋白以用于單克隆抗體的篩選，為研究ApxⅠA的生物學(xué)活性及其在疾病和疫苗免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。

在單克隆抗體制備過程中，陽性克隆的篩選選擇表達(dá)純化的融合蛋白rApxⅠA為包被抗原，采用間接ELISA檢測(cè)，避免了融合蛋白中His Tag標(biāo)簽蛋白的干擾，確保了單克隆抗體的特異性。通過方陣滴定法確定了間接ELISA抗原的包被濃度與腹水的最佳稀釋度分別為1∶160（此時(shí)蛋白濃度約為50μg／mL）和1∶1 000。研制出的2株分泌抗ApxⅠA的雜交瘤細(xì)胞系經(jīng)ELISA和Western blot鑒定，具有良好的特異性和穩(wěn)定性，為進(jìn)一步建立豬胸膜肺炎放線桿菌檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

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