莫勝蘭，鄭 敏，陳義祥，胡 杰，屈素潔，梁 媛，粟艷瓊，2，陸文俊，蘇 凱，陳玉華，李 軍，劉 棋，2＊

（1.廣西動物疫病預防控制中心，廣西南寧 530001；2.廣西大學動物科技學院，廣西南寧 530001）

水禽可以自然感染A型禽流感病毒的所有亞型，并通過多種途徑直接或間接地將病毒傳染給其他禽類和哺乳動物，被認為是禽流感病毒基因儲存庫和新毒株的重要來源，因此，在禽流感病毒的遺傳進化和流行病學中具有重要意義［1－2］。根據(jù)表面糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神經氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性不同，A型禽流感病毒（Influenza A virus）可分成16個不同的HA亞型和9個NA亞型［3］。在眾多A型禽流感病毒亞型中，只有H5和H7亞型中的部分病毒才能引起高致病性禽流感，但越來越多的研究表明，禽類中的低致病性禽流感病毒（Low pathogenic avian influenza virus，LPAIV）往往通過基因重排方式產生新的病毒，一些新的病毒毒力增強或具有感染人的潛力。Wang C W 等［4－5］研究發(fā)現(xiàn)，對水禽無癥狀的 H6亞型禽流感病毒株在感染家雞后會引起蛋雞產蛋率下降和上呼吸道病變，甚至引起感染雞死亡，造成較大的經濟損失，其原因可能是H6亞型禽流感病毒在由水禽傳染至家雞的過程中毒力發(fā)生了變異而導致后者發(fā)病。另外，Chin P S等［6］報道，一株從野鴨體內分離到的 H6N2亞型禽流感病毒 A／teal／HongKong／W312／97（H6N2）與 能 致 人 死 亡 的H5N1亞型禽流感病毒株（A／Chick／HongKong／156／97（H5N1）的7個基因高度同源，推測前者很可能為后者提供了基因，使后者成為具有感染人能力的新病毒。因此，加強對H6等LPAIV的監(jiān)測具有重要的公共衛(wèi)生學意義。廣西自治區(qū)動物疫病預防控制中心在對廣西活禽市場進行禽流感病毒帶毒狀況的監(jiān)測過程中，從健康家鴨中分離鑒定出一株H6N6亞型禽流感病毒，將其命名為A／duck／GX／038／2009（H6N6）（Dk／GX／038／09），并對其 HA和NA基因進行了克隆和序列分析，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和試劑 禽流感病毒 Dk／GX／038／09由廣西區(qū)動物疫病預防控制中心分離鑒定和保存；Trizol試劑為Invitrogen公司產品；AMV逆轉錄酶及相關試劑、Taq DNA聚合酶、Agarose Gel DNA Purification Kit、pMD－18T載體等為寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.1.2 引物 依據(jù)GenBank上發(fā)表的H6N6亞型禽流感病毒HA和NA基因片段兩端核苷酸保守序列采用Primer 6.0軟件分別設計出2對引物，HA 基 因 引 物 6HA－R： 5′－ACAAGGGTGTTTTTCTTAAT－3′，6HA－F：5′－AGCAAAAGCAGGGGAAAA－3，預期擴增 HA基因片段為1 737bp；NA 基 因 引 物 6NA－F：5′－AGCAAAAGCAGGAGTGAAGA－3，6NA－R： 5′－TTTTCTAAAATTGCGAAAGC－3，預期擴增NA基因片段為1 449bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取 取250μL病毒尿囊液，加入750μL Trizol試劑，混勻后室溫靜置5 min，加入200μL氯仿，輕微振蕩混勻，4℃、12 000 r／min離心10min，取上清約500μL，加入0.5mL異丙醇，混勻后室溫靜置10min，12 000r／min離心10min，沉淀干燥后懸于適量的DEPC處理水中備用。

1.2.2 RT－PCR 取病毒RNA懸液15μL，與流感病毒隨機引物1μL（20pmol／μL）混合，加入 AMV逆轉錄酶5×buffer 5μL、dNTP（10mmol／L）2 μL、RNasin 1μL（20U）、AMV 逆轉錄酶1μL（5 U），逆轉錄反應體系為25μL。混合物置于42℃作用60min。PCR反應體系：10×Taq聚合酶緩沖液5μL，dNTP（10mmol／L）2μL，上、下游引物（20 pmol／μL）各1μL，cDNA 2.5μL，Taq DNA聚合酶1μL（5U），用無菌水補足至50μL。PCR反應條件：95℃2min；94℃35s，53℃35s，72℃2min，35個循環(huán)；72℃10min。取PCR產物5μL，在10 g／L瓊脂凝膠上電泳檢查結果。

1.2.3 PCR產物的回收、克隆和序列測定 PCR產物用Agarose Gel DNA Purification Kit回收后，與pMD－18T載體連接，轉化，藍白斑篩選重組質粒并用PCR鑒定。每個樣品挑取陽性克隆，由寶生物工程（大連）有限公司進行基因序列測定。

1.2.4 同源性分析和進化樹構建 應用DNA Star軟件對測序基因片段進行拼接和氨基酸序列推導，利用GenBank中的BLAST軟件查找核苷酸和氨基酸的同源序列，并用MEGA 4.0軟件繪制遺傳進化樹。

2 結果

2.1 HA和NA基因擴增

經10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴增到的HA基因片段長約1.7kb，擴增到的NA基因片段長約1.5kb，兩個基因的擴增結果與預期擴增長度一致（圖1）。

圖1 HA和NA基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification product of HA and NA gene

2.2 核苷酸同源性分析

測序結果顯示Dk／GX／038／09的 HA基因全長為1 737bp。利用GenBank中的BLAST工具進行同源性搜索比對顯示，Dk／GX／038／09的 HA基因與廣東 A／duck／Shantou／17887／2005（H6N6）、A／duck／Shantou／8379／2005（H6N2）等 H6亞型毒株HA基因核苷酸同源性最高，達97.0%；與江蘇A／duck／Jiangsu／022／2009（H6N6）和福建 A／duck／Fujian／12035／2005（H6N6）等 H6N6亞型毒株相應基因同源性則相對較低，分別為95%和93%。值得注意的是，Dk／GX／038／09的 HA基因核苷酸與廣西2005年鴨源 H6N2毒株 A／duck／Guangxi／141／2005的HA基因同源性更低，只有86.5%。

對 NA 基因的測序結果顯示，Dk／GX／038／09的NA基因片段長度為1 449bp，與GenBank中收錄的參考毒株進行了同源性比較。結果表明，Dk／GX／038／09的 NA 基 因與廣東 鴨源毒 株 如 A／duck／Shantou／20313／2005（H6N6）和福建鴨源毒株 A／duck／Fujian／11661／2005（H6N6）等的同源性最高，達98.0%；而與江蘇鴨源毒株 A／duck／Jiangsu／022／2009（H6N6）的NA基因核苷酸同源性則只有88.6%，差異較大。

2.3 基因推導氨基酸分析

對Dk／GX／038／09的 HA基因推導氨基酸分析顯示，其HA基因的編碼區(qū)全長為1 701bp，編碼566個氨基酸，HA1含有344個氨基酸，HA2含有221個氨基酸，不存在核苷酸缺失。HA1和HA2裂解位點的序列為 P－Q－I－E－T－R－D，僅含一個堿性氨基酸，具有典型低致病性禽流感病毒的特征序列。同時，該毒株HA受體結合位點氨基酸序列為K226－S227－P228－E229，與人類受體位點氨基酸序列不同，暫時不存在感染人的風險。

對Dk／GX／038／09的NA基因推導氨基酸分析顯示該基因編碼470個氨基酸，中間不存在任何氨基酸缺失。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，Dk／GX／038／09的NA基因氨基酸與廣東鴨源毒株A／duck／Shantou／8365／2005（H6N6）的相應氨基酸同源性最高，為 99%；與 江 蘇 鴨 源 毒 株 A／duck／Jiangsu／022／2009（H6N6）的相應氨基酸同源性較低，為93.0%。

2.4 HA和NA基因遺傳進化樹分析

圖2 HA基因進化圖Fig.2 Phylogenetic trees of HA gene

圖3 NA基因進化樹Fig.3 Phylogenetic trees of NA gene

HA基因遺傳進化樹（圖2）顯示，Dk／GX／038／09與廣東分離的多個鴨源H6N6毒株如A／duck／Shantou／8365／2005（H6N6）和 H6N2 毒株如 A／duck／Shantou／17887／2005（H6N2）等位于同一分支上，遺傳距離很近；而與江蘇、福建、香港以及臺灣等其他地區(qū)分離的H6亞型流感毒株的遺傳距離較遠。

在 NA基因進化樹上（圖3）顯示，Dk／GX／038／09與廣東、福建分離的H6N6亞型流感毒株位于同一個進化分支內；與江蘇、香港等地的H6亞型禽流感病毒分離株則位于不同的分支上，親緣關系較遠。

3 討論

本實驗室首次在廣西自治區(qū)分離到H6N6亞型禽流感病毒并對其HA和NA基因進行了序列分析和繪制基因遺傳進化樹，初步明確了該病毒在廣西的流行態(tài)勢。由于該病毒的NA和HA基因序列與廣東相應毒株最為接近，因而推測Dk／GX／038／09與廣東分離的H6N6亞型流感毒株可能來自同一祖先病毒，這也許與廣東和廣西密切的家禽產品交易相關。江蘇、香港、臺灣等地區(qū)分離的H6毒株親緣關系較遠，則表明目前在中國流行的H6亞型禽流感病毒存在一定的地域差異性和基因遺傳多樣性。同時，顧敏等［7］報道，江蘇分離的鴨源H6N6毒株 A／duck／Jiangsu／022／2009為基因重排病毒，8個基因比較復雜，但均屬于歐亞系。而萬春和等［8］也報道我國福建分離的另一株鴨源 H6N6毒株 A／Muscovy／duck／Fujian／FZ01／2008也為多亞型禽流感病毒基因重排產物。因此，Dk／GX／038／09也存在基因重排的可能性，但仍需要進一步證實其內部基因。

表面糖蛋白基因HA和NA之間的協(xié)調與病毒的增殖和復制密切相關，HA蛋白是禽流感病毒最主要的表面糖蛋白，而NA蛋白則在病毒的成熟和釋放中起重要作用。這兩個蛋白也是宿主免疫系統(tǒng)最主要的靶抗原［9］。HA基因的突變有可能引起抗原變異，使病毒能夠逃避宿主免疫壓力而獲得選擇優(yōu)勢［10］。本次研究發(fā)現(xiàn)，兩廣地區(qū)流行的H6N6病毒從2005年至2009年間其HA和NA基因核苷酸變異均較小，原因可能是H6N6亞型禽流感病毒相對于人禽流感病毒而言，所受的免疫壓力小。因為該病毒主要感染鴨，而鴨的飼養(yǎng)模式則決定了鴨的存活時間較短，對H6N6亞型禽流感病毒有免疫力的鴨較少，使得病毒不需過多地改變自身來適應宿主。所以近幾年來，流行于兩廣地區(qū)的H6N6亞型禽流感病毒基因進化沒有明顯加快的跡象，但新的基因重排H6N6亞型禽流感病毒增多的趨勢可能存在。

廣西處于中國溫暖潮濕的華南地區(qū)，是多種侯鳥遷徙路線的必經之地，同時該地區(qū)水網密布，四季放養(yǎng)或混養(yǎng)，這一特殊的生態(tài)環(huán)境加上該地區(qū)獨特的地理氣候條件和人們的生活習慣等，使得候鳥、水禽、豬、人頻繁接觸并交叉循環(huán)感染，具備禽流感病毒生存與傳播的天然條件，國外眾多學者把中國南方稱為“流感起源中心”［11］。因此，準確地了解和把握廣西水禽群體中的禽流感病毒的多樣性，對我國預防禽流感的發(fā)生是非常重要的。H6亞型禽流感病毒是我國南方地區(qū)家鴨中比較常見的亞型，因此，對H6亞型病毒進行跟蹤監(jiān)測可為預防和控制禽流感提供重要的流行病學信息。

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