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        廣西鴨源H6N6亞型禽流感病毒HA和NA基因的序列分析*

        2011-05-31 06:55:28莫?jiǎng)偬m陳義祥屈素潔粟艷瓊陸文俊陳玉華

        莫?jiǎng)偬m,鄭 敏,陳義祥,胡 杰,屈素潔,梁 媛,粟艷瓊,2,陸文俊,蘇 凱,陳玉華,李 軍,劉 棋,2*

        (1.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣西南寧 530001;2.廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,廣西南寧 530001)

        水禽可以自然感染A型禽流感病毒的所有亞型,并通過多種途徑直接或間接地將病毒傳染給其他禽類和哺乳動(dòng)物,被認(rèn)為是禽流感病毒基因儲存庫和新毒株的重要來源,因此,在禽流感病毒的遺傳進(jìn)化和流行病學(xué)中具有重要意義[1-2]。根據(jù)表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)抗原性不同,A型禽流感病毒(Influenza A virus)可分成16個(gè)不同的HA亞型和9個(gè)NA亞型[3]。在眾多A型禽流感病毒亞型中,只有H5和H7亞型中的部分病毒才能引起高致病性禽流感,但越來越多的研究表明,禽類中的低致病性禽流感病毒(Low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)往往通過基因重排方式產(chǎn)生新的病毒,一些新的病毒毒力增強(qiáng)或具有感染人的潛力。Wang C W 等[4-5]研究發(fā)現(xiàn),對水禽無癥狀的 H6亞型禽流感病毒株在感染家雞后會引起蛋雞產(chǎn)蛋率下降和上呼吸道病變,甚至引起感染雞死亡,造成較大的經(jīng)濟(jì)損失,其原因可能是H6亞型禽流感病毒在由水禽傳染至家雞的過程中毒力發(fā)生了變異而導(dǎo)致后者發(fā)病。另外,Chin P S等[6]報(bào)道,一株從野鴨體內(nèi)分離到的 H6N2亞型禽流感病毒 A/teal/HongKong/W312/97(H6N2)與 能 致 人 死 亡 的H5N1亞型禽流感病毒株(A/Chick/HongKong/156/97(H5N1)的7個(gè)基因高度同源,推測前者很可能為后者提供了基因,使后者成為具有感染人能力的新病毒。因此,加強(qiáng)對H6等LPAIV的監(jiān)測具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。廣西自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心在對廣西活禽市場進(jìn)行禽流感病毒帶毒狀況的監(jiān)測過程中,從健康家鴨中分離鑒定出一株H6N6亞型禽流感病毒,將其命名為A/duck/GX/038/2009(H6N6)(Dk/GX/038/09),并對其 HA和NA基因進(jìn)行了克隆和序列分析,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 病毒和試劑 禽流感病毒 Dk/GX/038/09由廣西區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心分離鑒定和保存;Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶及相關(guān)試劑、Taq DNA聚合酶、Agarose Gel DNA Purification Kit、pMD-18T載體等為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

        1.1.2 引物 依據(jù)GenBank上發(fā)表的H6N6亞型禽流感病毒HA和NA基因片段兩端核苷酸保守序列采用Primer 6.0軟件分別設(shè)計(jì)出2對引物,HA 基 因 引 物 6HA-R: 5′-ACAAGGGTGTTTTTCTTAAT-3′,6HA-F:5′-AGCAAAAGCAGGGGAAAA-3,預(yù)期擴(kuò)增 HA基因片段為1 737bp;NA 基 因 引 物 6NA-F:5′-AGCAAAAGCAGGAGTGAAGA-3,6NA-R: 5′-TTTTCTAAAATTGCGAAAGC-3,預(yù)期擴(kuò)增NA基因片段為1 449bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

        1.2 方法

        1.2.1 病毒RNA的提取 取250μL病毒尿囊液,加入750μL Trizol試劑,混勻后室溫靜置5 min,加入200μL氯仿,輕微振蕩混勻,4℃、12 000 r/min離心10min,取上清約500μL,加入0.5mL異丙醇,混勻后室溫靜置10min,12 000r/min離心10min,沉淀干燥后懸于適量的DEPC處理水中備用。

        1.2.2 RT-PCR 取病毒RNA懸液15μL,與流感病毒隨機(jī)引物1μL(20pmol/μL)混合,加入 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5×buffer 5μL、dNTP(10mmol/L)2 μL、RNasin 1μL(20U)、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶1μL(5 U),逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為25μL?;旌衔镏糜?2℃作用60min。PCR反應(yīng)體系:10×Taq聚合酶緩沖液5μL,dNTP(10mmol/L)2μL,上、下游引物(20 pmol/μL)各1μL,cDNA 2.5μL,Taq DNA聚合酶1μL(5U),用無菌水補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件:95℃2min;94℃35s,53℃35s,72℃2min,35個(gè)循環(huán);72℃10min。取PCR產(chǎn)物5μL,在10 g/L瓊脂凝膠上電泳檢查結(jié)果。

        1.2.3 PCR產(chǎn)物的回收、克隆和序列測定 PCR產(chǎn)物用Agarose Gel DNA Purification Kit回收后,與pMD-18T載體連接,轉(zhuǎn)化,藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒并用PCR鑒定。每個(gè)樣品挑取陽性克隆,由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行基因序列測定。

        1.2.4 同源性分析和進(jìn)化樹構(gòu)建 應(yīng)用DNA Star軟件對測序基因片段進(jìn)行拼接和氨基酸序列推導(dǎo),利用GenBank中的BLAST軟件查找核苷酸和氨基酸的同源序列,并用MEGA 4.0軟件繪制遺傳進(jìn)化樹。

        2 結(jié)果

        2.1 HA和NA基因擴(kuò)增

        經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,擴(kuò)增到的HA基因片段長約1.7kb,擴(kuò)增到的NA基因片段長約1.5kb,兩個(gè)基因的擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期擴(kuò)增長度一致(圖1)。

        圖1 HA和NA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification product of HA and NA gene

        2.2 核苷酸同源性分析

        測序結(jié)果顯示Dk/GX/038/09的 HA基因全長為1 737bp。利用GenBank中的BLAST工具進(jìn)行同源性搜索比對顯示,Dk/GX/038/09的 HA基因與廣東 A/duck/Shantou/17887/2005(H6N6)、A/duck/Shantou/8379/2005(H6N2)等 H6亞型毒株HA基因核苷酸同源性最高,達(dá)97.0%;與江蘇A/duck/Jiangsu/022/2009(H6N6)和福建 A/duck/Fujian/12035/2005(H6N6)等 H6N6亞型毒株相應(yīng)基因同源性則相對較低,分別為95%和93%。值得注意的是,Dk/GX/038/09的 HA基因核苷酸與廣西2005年鴨源 H6N2毒株 A/duck/Guangxi/141/2005的HA基因同源性更低,只有86.5%。

        對 NA 基因的測序結(jié)果顯示,Dk/GX/038/09的NA基因片段長度為1 449bp,與GenBank中收錄的參考毒株進(jìn)行了同源性比較。結(jié)果表明,Dk/GX/038/09的 NA 基 因與廣東 鴨源毒 株 如 A/duck/Shantou/20313/2005(H6N6)和福建鴨源毒株 A/duck/Fujian/11661/2005(H6N6)等的同源性最高,達(dá)98.0%;而與江蘇鴨源毒株 A/duck/Jiangsu/022/2009(H6N6)的NA基因核苷酸同源性則只有88.6%,差異較大。

        2.3 基因推導(dǎo)氨基酸分析

        對Dk/GX/038/09的 HA基因推導(dǎo)氨基酸分析顯示,其HA基因的編碼區(qū)全長為1 701bp,編碼566個(gè)氨基酸,HA1含有344個(gè)氨基酸,HA2含有221個(gè)氨基酸,不存在核苷酸缺失。HA1和HA2裂解位點(diǎn)的序列為 P-Q-I-E-T-R-D,僅含一個(gè)堿性氨基酸,具有典型低致病性禽流感病毒的特征序列。同時(shí),該毒株HA受體結(jié)合位點(diǎn)氨基酸序列為K226-S227-P228-E229,與人類受體位點(diǎn)氨基酸序列不同,暫時(shí)不存在感染人的風(fēng)險(xiǎn)。

        對Dk/GX/038/09的NA基因推導(dǎo)氨基酸分析顯示該基因編碼470個(gè)氨基酸,中間不存在任何氨基酸缺失。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),Dk/GX/038/09的NA基因氨基酸與廣東鴨源毒株A/duck/Shantou/8365/2005(H6N6)的相應(yīng)氨基酸同源性最高,為 99%;與 江 蘇 鴨 源 毒 株 A/duck/Jiangsu/022/2009(H6N6)的相應(yīng)氨基酸同源性較低,為93.0%。

        2.4 HA和NA基因遺傳進(jìn)化樹分析

        圖2 HA基因進(jìn)化圖Fig.2 Phylogenetic trees of HA gene

        圖3 NA基因進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic trees of NA gene

        HA基因遺傳進(jìn)化樹(圖2)顯示,Dk/GX/038/09與廣東分離的多個(gè)鴨源H6N6毒株如A/duck/Shantou/8365/2005(H6N6)和 H6N2 毒株如 A/duck/Shantou/17887/2005(H6N2)等位于同一分支上,遺傳距離很近;而與江蘇、福建、香港以及臺灣等其他地區(qū)分離的H6亞型流感毒株的遺傳距離較遠(yuǎn)。

        在 NA基因進(jìn)化樹上(圖3)顯示,Dk/GX/038/09與廣東、福建分離的H6N6亞型流感毒株位于同一個(gè)進(jìn)化分支內(nèi);與江蘇、香港等地的H6亞型禽流感病毒分離株則位于不同的分支上,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

        3 討論

        本實(shí)驗(yàn)室首次在廣西自治區(qū)分離到H6N6亞型禽流感病毒并對其HA和NA基因進(jìn)行了序列分析和繪制基因遺傳進(jìn)化樹,初步明確了該病毒在廣西的流行態(tài)勢。由于該病毒的NA和HA基因序列與廣東相應(yīng)毒株最為接近,因而推測Dk/GX/038/09與廣東分離的H6N6亞型流感毒株可能來自同一祖先病毒,這也許與廣東和廣西密切的家禽產(chǎn)品交易相關(guān)。江蘇、香港、臺灣等地區(qū)分離的H6毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn),則表明目前在中國流行的H6亞型禽流感病毒存在一定的地域差異性和基因遺傳多樣性。同時(shí),顧敏等[7]報(bào)道,江蘇分離的鴨源H6N6毒株 A/duck/Jiangsu/022/2009為基因重排病毒,8個(gè)基因比較復(fù)雜,但均屬于歐亞系。而萬春和等[8]也報(bào)道我國福建分離的另一株鴨源 H6N6毒株 A/Muscovy/duck/Fujian/FZ01/2008也為多亞型禽流感病毒基因重排產(chǎn)物。因此,Dk/GX/038/09也存在基因重排的可能性,但仍需要進(jìn)一步證實(shí)其內(nèi)部基因。

        表面糖蛋白基因HA和NA之間的協(xié)調(diào)與病毒的增殖和復(fù)制密切相關(guān),HA蛋白是禽流感病毒最主要的表面糖蛋白,而NA蛋白則在病毒的成熟和釋放中起重要作用。這兩個(gè)蛋白也是宿主免疫系統(tǒng)最主要的靶抗原[9]。HA基因的突變有可能引起抗原變異,使病毒能夠逃避宿主免疫壓力而獲得選擇優(yōu)勢[10]。本次研究發(fā)現(xiàn),兩廣地區(qū)流行的H6N6病毒從2005年至2009年間其HA和NA基因核苷酸變異均較小,原因可能是H6N6亞型禽流感病毒相對于人禽流感病毒而言,所受的免疫壓力小。因?yàn)樵摬《局饕腥绝?,而鴨的飼養(yǎng)模式則決定了鴨的存活時(shí)間較短,對H6N6亞型禽流感病毒有免疫力的鴨較少,使得病毒不需過多地改變自身來適應(yīng)宿主。所以近幾年來,流行于兩廣地區(qū)的H6N6亞型禽流感病毒基因進(jìn)化沒有明顯加快的跡象,但新的基因重排H6N6亞型禽流感病毒增多的趨勢可能存在。

        廣西處于中國溫暖潮濕的華南地區(qū),是多種侯鳥遷徙路線的必經(jīng)之地,同時(shí)該地區(qū)水網(wǎng)密布,四季放養(yǎng)或混養(yǎng),這一特殊的生態(tài)環(huán)境加上該地區(qū)獨(dú)特的地理氣候條件和人們的生活習(xí)慣等,使得候鳥、水禽、豬、人頻繁接觸并交叉循環(huán)感染,具備禽流感病毒生存與傳播的天然條件,國外眾多學(xué)者把中國南方稱為“流感起源中心”[11]。因此,準(zhǔn)確地了解和把握廣西水禽群體中的禽流感病毒的多樣性,對我國預(yù)防禽流感的發(fā)生是非常重要的。H6亞型禽流感病毒是我國南方地區(qū)家鴨中比較常見的亞型,因此,對H6亞型病毒進(jìn)行跟蹤監(jiān)測可為預(yù)防和控制禽流感提供重要的流行病學(xué)信息。

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