陸文俊，施開(kāi)創(chuàng)＊，屈素潔，莫?jiǎng)偬m，李向濤，鐘 誠(chéng)＊

（1.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005）

腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）可以引起多種家畜、野生動(dòng)物以腦炎、心肌炎及心肌周圍炎為主要特征的一種急性傳染病。EMCV可以感染人，嚙齒動(dòng)物是其自然貯存宿主。斷奶仔豬感染可造成急性死亡；成年豬感染呈現(xiàn)亞臨床癥狀，偶爾出現(xiàn)豬死亡；妊娠母豬感染除了引起流產(chǎn)等繁殖障礙外，通常并不造成豬死亡。EMCV是微RNA病毒科心病毒屬的惟一成員，病毒基因組全長(zhǎng)約7.8kb，含有5′非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）、3′UTR和一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）。EMCV在病毒粒子形成過(guò)程中，其前體蛋白最終裂解為結(jié)構(gòu)蛋白1A（VP4）、1B（VP2）、1C（VP3）、1D（VP1）和非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。其中，結(jié)構(gòu)蛋白 VP1的抗原性最強(qiáng)［1］。VP1蛋白刺激小鼠產(chǎn)生的多克隆抗體具有中和活性，可以中和EMCV在小鼠體內(nèi)的感染能力，表明VP1蛋白是EMCV重要的保護(hù)性抗原［2－3］。本研究以原核表達(dá)的VP1蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)EMCV抗體的間接ELISA方法，并應(yīng)用于臨床血清學(xué)調(diào)查，為有效防控該病提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 EMCV VP1重組蛋白 原核表達(dá)菌株pET－32a－VP1／BL21由廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室（以下簡(jiǎn)稱本實(shí)驗(yàn)室）構(gòu)建，并成功表達(dá)具有良好反應(yīng)原性的VP1重組蛋白［4］。經(jīng)純化，獲得4.8mg／mL的VP1蛋白，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 增強(qiáng)型HRP－DAB底物顯色試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品，馬血清為GIBCOBRL公司產(chǎn)品，脫脂奶粉為Oxiod公司產(chǎn)品，BSA為Solarbio公司產(chǎn)品；HRP－兔抗豬IgG為Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 血清 豬抗EMCV陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備，F(xiàn)MDV陽(yáng)性血清購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所；EMCV陰性血清及CSFV、PRRSV、PRV、PCV－2陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室提供；待檢血清2 228份于2010年－2011年分別采自廣西14個(gè)市的中小規(guī)模豬場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 間接ELISA最佳反應(yīng)條件的確定

1.2.1.1 抗原包被濃度及待檢血清稀釋度的確定采用矩陣法，將倍比稀釋的重組抗原包被后，加入不同稀釋度的待檢血清，進(jìn)行間接ELISA。取陽(yáng)性血清OD450nm值在1.0左右，陰性血清OD450nm值小于0.25，且陽(yáng)性／陰性（positive／negative，P／N）值最大的抗原濃度及待檢血清稀釋度作為最佳包被濃度及最佳稀釋度。

1.2.1.2 酶標(biāo)抗體工作濃度的確定 其他條件不變，加入1∶5 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000倍稀釋的酶標(biāo)抗體進(jìn)行間接ELISA，確定其最佳工作濃度。

1.2.1.3 封閉液的選擇 抗原包被后，分別用含10mL／L 牛血清白蛋白 （bovine serum albumin，BSA）、50mL／L馬血清、10g／L明膠、50g／L脫脂乳的PBST作為封閉液，進(jìn)行間接ELISA，選擇最佳的封閉液。

1.2.1.4 待檢血清作用時(shí)間的確定 酶標(biāo)板包被抗原、封閉后，加入陽(yáng)性血清分別置37℃反應(yīng)30 min、室溫反應(yīng)30min、37℃反應(yīng)45min、室溫反應(yīng)45min、37℃反應(yīng)60min、室溫反應(yīng)60min。進(jìn)行間接ELISA，確定最佳作用時(shí)間。

1.2.1.5 酶標(biāo)抗體作用時(shí)間的確定 將酶標(biāo)抗體按最佳稀釋度加入酶標(biāo)板，分別置37℃反應(yīng)30 min、室溫反應(yīng)30min、37℃反應(yīng)45min、室溫反應(yīng)45min、37℃反應(yīng)60min、室溫反應(yīng)60min。進(jìn)行間接ELISA，確定最佳作用時(shí)間。

1.2.1.6 底物作用時(shí)間的確定 酶標(biāo)抗體作用完成后，加入單組份可溶性TMB溶液，室溫避光分別顯色10、15、20、30min。進(jìn)行間接ELISA，確定最佳顯色時(shí)間。

1.2.1.7 陰性與陽(yáng)性臨界值的確定 選取30份經(jīng)中和試驗(yàn)確定為EMCV抗體陰性的血清，按照優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行間接ELISA，計(jì)算出30份血清OD450nm值的平均值（ˉX ）和標(biāo)準(zhǔn)方差（standard deviation，SD）。當(dāng)被檢樣品的OD450nm值≥（ˉX＋3SD）時(shí)，判定為陽(yáng)性；當(dāng)樣品OD450nm值＜（ˉX＋3SD）時(shí)，判定為陰性。

1.2.2 特異性試驗(yàn) 分別取 FMDV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV－2的陽(yáng)性血清，同時(shí)設(shè)立 EMCV陰、陽(yáng)性血清對(duì)照。血清1∶40倍稀釋后，進(jìn)行間接ELISA，觀察各種血清是否與重組抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.2.3 廣西省EMCV感染的血清學(xué)調(diào)查 應(yīng)用所建立的間接ELISA方法，對(duì)2 228份血清進(jìn)行EMCV抗體檢測(cè)。主要步驟為：以pH 9.6、濃度為0.05 mol／L的碳酸鹽緩沖液做包被液，將抗原稀釋為0.625μg／mL，取100μL加入酶標(biāo)板，室溫作用2h后4℃包被過(guò)夜，取出酶標(biāo)板用PBST洗滌3次，每次5min；用100μL 50g／L脫脂乳于37℃封閉1h后，如上洗滌3次；加入100μL 1∶40倍稀釋的待檢血清，置37℃孵育1h后，用PBST洗滌3次；加入100μL 1∶6 000倍稀釋的兔抗豬IgG酶標(biāo)抗體，37℃作用30min后，洗滌3次；加入100μL可溶性單組份TMB底物溶液，室溫避光顯色15min；以每孔50μL 2mol／L H2SO4終止反應(yīng)；在酶聯(lián)檢測(cè)儀上讀取OD450nm值。當(dāng)待檢血清OD450nm值≥0.33時(shí)判定為EMCV抗體陽(yáng)性，當(dāng)樣品OD450nm值＜0.33時(shí)判定為陰性。

2 結(jié)果

2.1 間接ELISA方法最佳反應(yīng)條件的確定

表1 最佳抗原包被濃度和待檢血清稀釋度的確定Table 1 Determination of the coating concentration of antigen and the dilution of serum samples

2.1.1 最佳抗原包被濃度及待檢血清稀釋度的確定結(jié)果見(jiàn)表1。當(dāng)抗原濃度為0.625μg／mL、待檢血清以1∶40倍稀釋時(shí)，陽(yáng)性血清OD450nm值為1.074，陰性血清 OD450nm值0.226，P／N 值最大，故確定為最佳的抗原包被濃度和待檢血清稀釋度。

2.1.2 酶標(biāo)抗體最佳工作濃度的確定 結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)酶標(biāo)抗體稀釋度為1∶6 000時(shí)P／N值最大，故將其作為最佳工作濃度。

表2 酶標(biāo)抗體最佳工作濃度的確定Table 2 Determination of the optimal working concentration of HRP－labeled rabbit anti－porcine IgG

2.1.3 封閉液濃度的選擇 結(jié)果見(jiàn)表3。當(dāng)以50 g／L脫脂乳作為封閉液時(shí)P／N值最大，故選其作為封閉液工作濃度。

2.1.4 待檢血清最佳作用時(shí)間的確定 結(jié)果見(jiàn)表4。當(dāng)待檢血清在37℃反應(yīng)60min時(shí)，陽(yáng)性血清的OD450nm值最接近于1.0，且P／N值最大，故確定其為最佳作用時(shí)間。

2.1.5 酶標(biāo)抗體作用時(shí)間的確定 結(jié)果見(jiàn)表5。當(dāng)酶標(biāo)抗體在37℃與待檢血清作用30min時(shí)，陰性血清的OD450nm值較低，陽(yáng)性血清的OD450nm值接近1.0，且P／N值最大，故確定其為最佳作用時(shí)間。

表3 封閉液的確定Table 3 Determination of the blocking solution

2.1.6 底物最佳作用時(shí)間的確定 結(jié)果見(jiàn)表6。當(dāng)TMB在室溫條件下與酶標(biāo)抗體作用15min時(shí)，陰性血清的OD450nm值較低，陽(yáng)性血清的OD450nm值接近1.0，且P／N值最大。因此，確定底物最佳顯色時(shí)間為室溫15min。

2.1.7 陰陽(yáng)性臨界值的確定 30份陰性血清經(jīng)間接ELISA方法檢測(cè)，其OD450nm值最高者為0.299，最低者為0.221。平均值（ˉX）為0.267，標(biāo)準(zhǔn)方差（SD）為0.02157，ˉX＋3SD＝0.33。因此，陰陽(yáng)性血清的臨界值為0.33。當(dāng)待檢血清的OD450nm值≥0.33時(shí)，判定為陽(yáng)性；當(dāng)待檢血清的OD450nm值＜0.33時(shí)，判定為陰性。

表4 血清最佳反應(yīng)條件的確定Table 4 Determination of the optimal reacting conditions of serum samples

表5 酶標(biāo)抗體最佳反應(yīng)條件的確定Table 5 Determination of the optimal reacting conditions of HRP－labeled rabbit anti－porcine IgG

表6 最佳顯色時(shí)間的確定Table 6 Determination of the optimal coloration time

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

特異性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。EMCV VP1重組抗原與FMDV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV－2陽(yáng)性血清反應(yīng)后，其OD450nm值均小于0.33，表明無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。

2.3 廣西EMCV感染的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

對(duì)2010年－2011年從廣西各地采集的2 228份豬血清樣品應(yīng)用所建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表8。采自廣西14個(gè)市的豬血清樣品，陽(yáng)性率最高可達(dá)100%，最低也有83.33%，平均陽(yáng)性率達(dá)到91.47%，并且來(lái)自每個(gè)豬場(chǎng)的血清樣品均可檢出陽(yáng)性樣品，豬場(chǎng)陽(yáng)性率達(dá)到100%，表明廣西地區(qū)豬群感染EMCV非常嚴(yán)重。

表7 間接ELISA方法的特異性試驗(yàn)Table 7 The specificity of the indirect ELISA

表8 廣西豬血清樣品間接ELISA檢測(cè)結(jié)果Table 8 The detection results of swine serum samples from Guangxi by indirect ELISA

3 討論

EMCV是微RNA病毒科心病毒屬的成員，其結(jié)構(gòu)蛋白VP1由277個(gè)氨基酸組成，在結(jié)構(gòu)蛋白中的抗原性最強(qiáng)，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，常是基因疫苗研究的重點(diǎn)區(qū)域［2－3］，也是利用基因工程技術(shù)制備診斷抗原的首選基因［5－6］。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用原核表達(dá)載體pET－32a（＋）構(gòu)建含有EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因的重組質(zhì)粒，并利用大腸埃希菌成功表達(dá)了具有良好反應(yīng)原性的VP1重組蛋白［4］。本研究將純化的VP1蛋白作為包被抗原，經(jīng)過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，獲得最佳的抗原包被濃度為0.625μg／mL、待檢血清稀釋倍數(shù)為1∶40倍、酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為1∶6 000倍、封閉液為50g／L脫脂乳、底物作用時(shí)間為室溫避光15min，并且重組抗原VP1與豬主要病原FMDV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV－2的陽(yáng)性抗體不發(fā)生交叉反應(yīng)，由此成功建立了檢測(cè)豬EMCV抗體的間接ELISA方法。

間接ELISA由于其操作簡(jiǎn)單、快速、敏感性高，而且適用于大規(guī)模的樣品檢測(cè)，成為臨床上常用的檢測(cè)方法。本研究應(yīng)用所建立的間接ELISA方法、對(duì)采集自廣西各地的2 228份血清樣品進(jìn)行EMCV抗體的檢測(cè)，結(jié)果被檢血清樣品的平均陽(yáng)性率為91.47%，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為100%，表明廣西地區(qū)豬群已普遍感染EMCV。董艷嬌等［6］應(yīng)用間接ELISA方法對(duì)天津市7個(gè)縣市66個(gè)豬場(chǎng)295份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清樣品EMCV抗體的平均陽(yáng)性率為84.75%，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為93.94%；張家龍等［7］應(yīng)用間接ELISA方法對(duì)全國(guó)13個(gè)?。ㄊ校?6個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的3 250份血清樣品進(jìn)行EMCV抗體檢測(cè)，血清樣品的平均陽(yáng)性率為72%，豬場(chǎng)的陽(yáng)性率為100%；Ge X等［8］應(yīng)用中和試驗(yàn)對(duì)我國(guó)14個(gè)?。ㄊ校?8個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)2042份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，血清樣品EMCV抗體平均陽(yáng)性率為52.45%，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為97.37%。與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)豬血清樣品的陽(yáng)性率相比，廣西地區(qū)豬群的陽(yáng)性率偏高，這可能與廣西地處亞熱帶地區(qū)，氣候炎熱、雨水豐沛、植被茂密，作為EMCV自然貯存宿主的嚙齒類動(dòng)物特別是老鼠活動(dòng)猖獗，與豬群頻繁接觸，從而造成了豬群的感染與傳播有關(guān)。由于鼠類是EMCV在豬群中傳播的關(guān)鍵因素［9］，也對(duì)EMCV在野生動(dòng)物的感染與傳播中扮演重要角色［10］。因此，搞好環(huán)境衛(wèi)生、消滅鼠源，是防控豬腦心肌炎的一項(xiàng)有效措施。同時(shí)，來(lái)自廣西不同地市的豬血清樣品，其EMCV抗體陽(yáng)性率沒(méi)有明顯差異，表明EMCV感染在廣西沒(méi)有明顯的地域特征，這可能與活豬大量交易、跨地區(qū)流動(dòng)頻繁密切相關(guān)。

本研究利用EMCV VP1重組蛋白作為包被抗原，經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)條件，成功建立了檢測(cè)EMCV抗體的間接ELISA方法，并應(yīng)用該法對(duì)廣西地區(qū)EMCV感染情況進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，為有效防控豬腦心肌炎提供了技術(shù)支持。

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