龍云鳳，祝 賀，楊建明，陳朝銀，徐維佳，周曉黎，董 俊，葉玲玲，艾 軍＊

（1.昆明理工大學(xué)，云南昆明 650224；2.云南出入境檢驗檢疫局，云南昆明 650228）

小反芻獸疫（Peste des petits ruminants，PPR）是由小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的臨床以發(fā)熱、口炎、腹瀉和肺炎為主要特征的小反芻動物的一種急性高度接觸性傳染病，對綿羊和山羊的發(fā)病率和病死率分別高達100%和90%［1］，在發(fā)展中國家引起嚴(yán)重的社會經(jīng)濟問題，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必需報告的動物疫病［2］，在我國列為一類動物疫病。該病于1942年在非洲西部的象牙海岸首次暴發(fā)［3］，其后流行于撒哈拉以南和赤道以北的多數(shù)非洲國家，中東到土耳其的幾乎所有國家，南亞、西亞、印度和它的鄰國都廣泛傳播，在全球分布呈擴散和從西向東移動的趨勢［4］。2007年7月，該病首次傳入我國［5］，暴發(fā)于西藏阿里地區(qū)，對該地區(qū)的畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

PPRV屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbolivirus）。PPRV目前分為4個系，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ系源于非洲，Ⅳ系源于亞洲，該病毒僅有1個血清型［6－7］。PPRV的基因組是不分節(jié)段的單股負鏈 RNA，從3＇到5＇依次是 N－P－M－F－H－L 6個基因，分別編碼核（N）蛋白、磷（P）蛋白、基質(zhì)（M）蛋白、融合（F）蛋白、血凝素（H）蛋白、聚合酶（L）蛋白6種結(jié)構(gòu)蛋白和2種非結(jié)構(gòu)蛋白（C和V）［8－9］。其中編碼核蛋白的N基因總長度為1 689nt，包含一個開放閱讀框（ORF），長度為1 578nt，編碼525個氨基酸［10］。N蛋白在病毒蛋白中含量最高，是病毒粒子的主要組成部分，被認為在病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起主要作用［11］。N蛋白的抗原性穩(wěn)定，在病毒感染的動物血清中針對N蛋白的抗體占主導(dǎo)地位，但是此類 抗 體 不 具 有 中 和 病 毒 的 作 用［12－13］。此 外，PPRV與同屬的牛瘟病毒（RPV）的N基因核苷酸有65.8%的同源性，針對N蛋白的單克隆抗體可用于鑒別診斷與PPRV有血清學(xué)交叉反應(yīng)的RPV。

目前針對小反芻獸疫沒有有效的治療手段，主要靠疫苗接種進行防控。建立快速有效的檢測方法顯得十分重要。本試驗利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)，旨在獲得具有較好抗原活性的N蛋白，為制備針對PPRV N蛋白特異性表位的單克隆抗體及建立快速診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種和細胞 pBluescriptsk－PPRV－N重組質(zhì)粒（攜帶人工合成的PPRV N基因），其中N基因參照序列來自GenBank公布的PPRV Nigeria75／1的全基因組序列（GenBank登錄號：X74443），由寶生物工程（大連）有限公司合成；pFastBacHTA質(zhì)粒、Top10 E.coli和 DH10BAC E.coli菌種由云南出入境檢驗檢疫局動檢實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 質(zhì)粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒為AxyGEN公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶EcoR I和KpnI、DNA Marker、T4連接酶為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清、Grace＇s細胞培養(yǎng)基為GBICO公司產(chǎn)品；抗HIS單抗為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；山羊抗小鼠IgG／辣根酶（HRP）標(biāo)記為Southern Biotech公司產(chǎn)品；PCR儀為Eppondof公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)PPRV Nigeria75／1堿基序列設(shè)計了一對引物用于N基因的擴增和鑒定，PPRVE：5′－GGGAATTCATGGCTACTCTCCTTAAAAG－3′；PPRVK：5′－TT GGTACCTTTC AGCTGAGGAGATCCTTGTG－3′；下劃線分別為EcoRⅠ和KpnⅠ限制性酶切位點，目的片段擴增長度為1 578bp。參照Bac－to－Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)使用手冊，設(shè)計用于鑒定DH10Bac桿粒通用引物（M13）， M13Forward：5′－GTTTTCCCAGTCACGAC－3′；M13Reverse：5′－CAGGAAACAGCTATGAC－3′。引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴增與純化 用設(shè)計的特異性引物PPRVE／PPRVK對重組質(zhì)粒pBluescriptsk－PPRV－N進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：94℃3min；94℃30s，50℃30s，72℃100s，共30個循環(huán)；72℃7min；4℃ 結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。同時按照凝膠回收試劑盒操作步驟對PCR產(chǎn)物進行純化。

1.2.2 重組供體質(zhì)粒pFastBacHTA－PPRV－N 的構(gòu)建 純化后的PPRV N基因PCR擴增片段經(jīng)過EcoRⅠ和KpnⅠ特異性雙酶切后克隆至經(jīng)過同樣酶切處理的pFastBacHTA載體中，獲得重組供體質(zhì)粒pFastBacHTA－PPRV－N，對其進行PCR、雙酶切鑒定并送寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.2.3 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 質(zhì)粒 pFast－BacHTA－PPRV－N按照常規(guī)程序轉(zhuǎn)化含桿狀病毒穿梭載體的DH10Bac感受態(tài)細胞，加入室溫下的LB培養(yǎng)基800μL，37°C搖床培養(yǎng)5h，1 000r／min離心10min后棄上清600μL，重懸后涂布于含卡那霉素（50μg／mL）、四環(huán)素（7μg／mL）和慶大霉素（10μg／mL）的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)48h。

1.2.4 重組穿梭質(zhì)粒的鑒定 從平板上挑取形態(tài)良好的單菌落接種于含卡那霉素（50μg／mL）、四環(huán)素（7μg／mL）和慶大霉素（10μg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床過夜培養(yǎng)后按照Bac－to－Bac操作手冊中的操作步驟提取重組穿梭質(zhì)粒Bacmid－PPRV－N，使用引物 M13和PPRVE／PPRVK同時進行PCR，鑒定目的基因是否插入。

1.2.5 重組穿梭質(zhì)粒在昆蟲細胞中的表達 按照Invitrogen Bac－to－Bac Baculovirus Expression System使用說明手冊，將重組穿梭質(zhì)粒Bacmid－PPRVN在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染對數(shù)期生長的Sf9昆蟲細胞。轉(zhuǎn)染后28℃培養(yǎng)96h，反復(fù)凍融3次后3 000r／min離心10min，收集上清作為病毒原種感染Sf9細胞，28℃培養(yǎng)96h后按同樣方法收集上清即為P2代病毒。

1.2.6 重組病毒的 SDS－PAGE 鑒定和 Western blot分析 取P2代重組病毒感染細胞裂解物上清用120g／L的分離膠進行SDS－PAGE，將電泳后的凝膠進行轉(zhuǎn)印硝酸纖維膜，一抗為抗His標(biāo)記的鼠源抗體（1∶3 000倍稀釋），二抗為羊抗鼠IgG－HRP（1∶3 000倍稀釋），以正常細胞上清為陰性對照，按常規(guī)步驟做Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴增

用引物PPRVE／PPRVK對重組質(zhì)粒pBluescriptsk－PPRV－N進行擴增，在1 578bp處出現(xiàn)單一條帶（圖1），證明獲得克隆所需的目的基因片段。

圖1 重組質(zhì)粒pBluescriptsk－PPRV－N的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of recombinant plasmid pBluescriptsk－PPRV－N

2.2 重 組 供 體 質(zhì) 粒 pFastBacHTA－PPRV－N 的鑒定

重 組 質(zhì) 粒 pFastBacHTA－PPRV－N 用 引 物PPRVE／PPRVK進行PCR初步鑒定，擴增產(chǎn)物為1 578bp，與理論值相符。經(jīng)EcoR I和KpnI雙酶切可以在5 000bp和1 578bp處看到2個條帶（圖2），大小與預(yù)期結(jié)果相符，進一步測序結(jié)果證實插入的外源目的片段大小及閱讀框正確，證明已成功構(gòu)建了重組供體質(zhì)粒pFastBacHTA－PPRV－N。

圖2 pFastBacHTA－PPRV－N酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid of pFastBacHTA－PPRV－N by enzyme digestion

2.3 重組穿梭質(zhì)粒Bacmid－PPRV－N的PCR鑒定

pFastBacHTA－PPRV－N 轉(zhuǎn) 入 DH10Bac感 受態(tài)細胞后，經(jīng)慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素平皿篩選后，提取其DNA，用 M13正向和反向引物和PPRVE／PPRVK同時進行PCR鑒定，擴增產(chǎn)物分別為4 008bp和1 578bp（圖3泳道1和3）。未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的DH10Bac菌株擴增出300bp的目的條帶（圖3泳道2），證明目的片段已經(jīng)成功轉(zhuǎn)座到Bacmid，重組穿梭質(zhì)粒Bacmid－PPRV－N構(gòu)建成功。

2.4 重組蛋白在昆蟲細胞中表達

提取轉(zhuǎn)座桿粒DNA，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染對數(shù)期生長的Sf9昆蟲細胞，28℃培養(yǎng)96h后，倒置顯微鏡下觀察細胞，重組Bacmid－PPRV－N 轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞后，于48h后可見細胞病變，與正常細胞相比，細胞變大、變圓（圖4）。

2.5 重組蛋白的SDS－PAGE和 Western blot

將重組病毒感染的細胞裂解上清用120g／L的分離膠進行SDS－PAGE，結(jié)果在約61.3ku左右可見表達產(chǎn)物，和預(yù)期大小一致（圖5）。Western blot檢測，在約61.3ku左右處出現(xiàn)特異性印跡，而正常細胞上清中在此位置沒有出現(xiàn)特異性印跡（圖6）。

圖3 重組質(zhì)粒Bacmid－PPRV－N的PCR鑒定Fig.3 PCR Identification of the recombinant plasmid Bacmid－PPRV－N

圖4 重組蛋白在Sf9昆蟲細胞上表達（10×16）Fig.4 Expression of recombination protein in Sf9cells

圖5 PPRV－N重組蛋白SDS－PAGE分析Fig.5 SDS－PAGE analysis of recombinant protein PPRV－N

圖6 Bacmid－PPRV－N重組蛋白 Western blot分析Fig.6 Analysis of recombinant protein PPRV－N with Western blot

3 討論

小反芻獸疫是一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，發(fā)病率和病死率都非常高。2007年7月該病首次在我國西藏自治區(qū)暴發(fā)，雖然及時采取有效手段撲滅了這次疫情，但也提醒我國必須加強相關(guān)研究以應(yīng)對可能再次出現(xiàn)的疫情。在PPRV的蛋白中，N蛋白含量是最豐富的，不僅高度保守，還具有較強的免疫原性?；贜基因及N蛋白發(fā)展起來的診斷技術(shù)可以有效地區(qū)分小反芻獸疫和牛瘟。許多學(xué)者進行了N基因的表達，制備了相應(yīng)的單克隆抗體。Libeau G等［14］利用重組的桿狀病毒表達了小反芻獸疫病毒的核蛋白，制備了單克隆抗體，建立了c－ELISA檢測方法；印春生［15］通過人工合成N蛋白的3條抗原表位基因，篩選出了能鑒別小反芻獸疫病毒與牛瘟病毒陽性血清的Pep2多肽，且制備了相關(guān)的單克隆抗體，建立了間接ELISA診斷方法。李偉等［16］利用桿狀病毒－昆蟲表達系統(tǒng)成功表達了PPRV的N蛋白，并將此蛋白純化后作為包被抗原，建立了檢測PPRV血清抗體的間接ELISA方法。吳紹強等［17］以PPRV的N基因作為靶基因，借助熒光PCR技術(shù)建立了PPRV的快速病原學(xué)檢測方法并應(yīng)用于相關(guān)動物或動物產(chǎn)品的檢測。艾軍等［18］已成功進行了小反芻獸疫病毒N蛋白的原核表達。原核表達系統(tǒng)具有操作簡單、表達量高的顯著特點，但是表達產(chǎn)物大多以無生物學(xué)活性、不溶性的包涵體形式存在。因此，為獲得具有較好生物活性的PPRV N蛋白，在本試驗中，選用昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)對PPRV N基因進行表達。

桿狀病毒表達系統(tǒng)是一個利用桿狀病毒作為載體，在昆蟲培養(yǎng)細胞或蟲體中表達外源蛋白的真核表達系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)由于對外源基因克隆容量大，重組病毒易于篩選，具有完備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)和高效表達外源基因的能力等特點，因此是表達大片段DNA的理想載體，也是表達有生物活性的可溶性蛋白質(zhì)的理想載體［19］。本研究中所用的Bac－to－Bac表達系統(tǒng)是效率很高的桿狀病毒表達系統(tǒng)，它利用穿梭質(zhì)粒bacmid在大腸埃希菌中高效復(fù)制后，再提純用于轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，大大縮短了時間。本研究采用該表達系統(tǒng)表達PPRV N蛋白，主要是為了得到更接近于天然構(gòu)象且能最大限度保存蛋白抗原表位的重組蛋白質(zhì)。一方面，用昆蟲細胞表達的重組蛋白能夠與抗PPRV的抗體識別，因此可以建立用于PPRV血清學(xué)診斷的酶聯(lián)免疫吸附試驗；另一方面，也為制備針對PPRV N蛋白的特異性單克隆抗體提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

［1］Dhara P，Sreenivasaa B P，Barrettb T，et al.Recent epidemiology of peste des petits ruminants virus（PPRV）［J］.Vet Microbiol，2002，88：153－159.

［2］世界動物衛(wèi)生組織.陸生動物衛(wèi)生法典［S］.16版.世界動物衛(wèi)生組織官方網(wǎng)站.2007.

［3］Gargadennec L，Lawman A.La peste des petits ruminants［J］.Bulletin des Services Zoo Techniques des Epizootie del＇Afrique Occidentale Francaise，1942，5（6）：16－21.

［4］蔣 梅，楊仕標(biāo)，張念祖.小反芻獸疫的流行趨勢與防控［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2007，28（S）：88－91.

［5］王志亮，包靜月，吳曉東，等.我國首例小反芻獸疫診斷報告［J］.中國動物檢疫，2007，24（8）：24－26.

［6］Kwiatek Q，Minet C，Grillet C，et al.Peste des petits ruminants（PPR）outbreak in Tajikistan［J］.Comp Pathol，2007，136（2／3）：111－119.

［7］南文金，王清華，吳曉東，等.小反芻獸疫病毒分子生物學(xué)與疫苗研究進展［J］.中國動物檢疫，2009，26（1）：62－65.

［8］Bailey D，Banyard A，Dash P，et al.Full genome sequence of peste des petits ruminants virus，a member of the Morbillivirus genus［J］.Virus Research，2005，110：119－124.

［9］李井春，趙鳳菊，趙玉軍.小反芻獸疫［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2004（12）：63－64.

［10］Diallo A，Barrett T，Barbron M，et al.Cloning of the nucleocapsid protein gene of peste－des－petits－ruminants virus：relationship to other morbilliviruses［J］.J Gen Virol，1994，75（Pt1）：233－237.

［11］杭柏林，胡建和，姚四新，等.小反芻獸疫病毒蛋白及其功能研究進展［J］.信陽師范學(xué)院學(xué)報，2009，22（1）：152－156.

［12］阮 洋，秦峻嶺，高玉偉，等.小反芻獸疫病毒N基因的原核表達［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2011，32（3）：21－25.

［13］徐向明，張 良.小反芻獸疫研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（1）：113－116.

［14］Libeau G，Prehaud C，Lancelot R，et al.Development of a competitive ELISA for detecting antibodies to the peste des petits ruminants virus using a recombinant nucleoprotein［J］.Res Vet Sci，1995，58：50－55.

［15］印春生.小反芻獸疫病毒N蛋白抗原表位多肽的合成及競爭ELISA方法的建立［D］.北京：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，2007：100－115.

［16］李 偉，李 剛，吳曉東，等.小反芻獸疫病毒N基因重組桿狀病毒的構(gòu)建及間接ELISA抗體檢測方法的建立［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2011，41（9）：1147－1153.

［17］吳紹強，林祥海，劉忠清，等.小反芻獸疫實時熒光PCR檢測方法的建立及應(yīng)用［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（5）：18－20.

［18］艾 軍，楊建明，葉玲玲，等.小反芻獸疫病毒N基因的克隆及原核表達［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2008，29（5）：1－3.

［19］Matsuura Y，Possee R D，Overton H A，et al.Baculovirus expression vectors：the requirement for high level，expression of proteins including glycoprotein［J］.J Gen Virol，1987，68（5）：1233.