丁 明，陳少妃，徐耀華

(浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 313000)

黃條金剛竹 (Pleioblastus kongosanensis f.aureostriaus)，混生竹，稈高0.5～1 m，徑0.2～0.3 cm。葉片較寬大，綠色，不規(guī)則間有黃條紋，是北美箭竹超族北美箭竹族北美箭竹亞族大明竹屬大明竹亞屬，是大明竹屬金剛竹的一個變種。黃條金剛竹是一種觀葉竹種，非常美麗，觀賞價值高［1-2］。由田中辛南于1972年在名古屋市的守山鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)，1986年被引進(jìn)南京林業(yè)大學(xué)竹種園，國內(nèi)主要分布于浙江和江蘇［3］。

竹子中含有大量的黃酮類化合物和其他生物活性成分，如酚類、蒽醌類、香豆素類內(nèi)酯、活性多糖、特種氨基酸等，其中黃酮是主要的有效成分并具有顯著的生理功能，如抗活性氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抗衰老、降低血脂、抗菌抑菌、增強(qiáng)免疫力等，而且竹葉黃酮安全無毒，其安全性大大高于銀杏提取物，由此竹葉黃酮類物質(zhì)的提取純化及功能作用的研究已成為一個熱點(diǎn)［4-6］。目前，國內(nèi)外對黃條金剛竹中所含黃酮情況尚未報到，經(jīng)本組研究發(fā)現(xiàn)黃條金剛竹中總黃酮含量為0.44%～0.71%，雖比多數(shù)竹類總黃酮含量較低，但其具有生長速度快，可反復(fù)割采等特點(diǎn)，是一個相當(dāng)豐富的潛在資源。

本文通過正交試驗(yàn)考察了多種因素對于竹葉黃酮提取效果的影響，對總黃酮提取和含量測定進(jìn)行研究，旨在為天然黃酮類物質(zhì)的提取條件的優(yōu)化提供有益的參數(shù)，為黃條金剛竹的開發(fā)利用提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

竹子樣品。分別于2010年6月1日和2010年8月3日采自浙江農(nóng)林大學(xué)校園竹種園;竹子經(jīng)過如下處理:洗凈，烘干，粉碎，過篩 (60目篩)，棕色磨口瓶保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑。蘆丁對照品 (中國藥品生物制品檢定所)，甲醇、乙醇、AlCl3、Al(NO3)3、NaNO2、CH3COOK、NaOH(均為分析純)，水 (Ⅰ級)。

儀器。CHA-S型恒溫振蕩器 (國華電器有限公司);PHS-4 A型智能酸度計 (上海虹益儀器儀表有限公司);DK-S22型數(shù)顯恒溫水浴鍋 (上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);FZ102植物試樣粉碎機(jī)(齊家務(wù)科學(xué)儀器廠);60目試樣標(biāo)準(zhǔn)篩 (浙江上虞華康化驗(yàn)儀器廠);DF-101 S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 (鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);SHZC型循環(huán)水式多用真空泵 (鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);DGG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);BS224 S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器 (北京)有限公司);T6紫外可見分光光度計 (北京普析通用儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的提取

稱取干燥粉碎的竹粉2.00 g置于潔凈的平底燒瓶中，加人30 mL 70%乙醇溶劑，放置24 h浸泡，然后移至恒溫水浴鍋浸提;提取條件:水浴恒溫，浸提1.5 h，經(jīng)過2次浸提，將提取液轉(zhuǎn)入250 mL棕色容量瓶中定容，避光保存。

1.2.2 提取物的光譜測定

研究表明［7］，竹葉黃酮主要是黃酮糖苷，并以C-甙為主，4種主要的竹葉碳甙黃酮分別是葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷。

提取液的紫外/可見光譜圖。移取10 mL竹粉提取液于棕色50 mL容量瓶中，用乙醇補(bǔ)至18 mL，先加5%亞硝酸鈉溶液1.2 mL，搖勻，放置10 min;再加10%硝酸鋁溶液1.2 mL，搖勻 (溶液無色)，放置10 min，加入1 mol·L-1的氫氧化鈉8 mL，搖勻，此時溶液呈銅紅色。用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置10 min后。在波長200～800 nm、吸光度-0.020～5.000范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，測其最大吸收波長 (λmax和吸收光度 D)，不加顯色劑做為對照。其結(jié)果見圖1所示，該提取物在240～280 nm和300～400 nm下有類似黃酮結(jié)構(gòu)的特征吸收，且加入顯色劑后300～400 nm波長下有明顯減弱現(xiàn)行，可能為黃酮的酚羥基離解或形成絡(luò)合物等，導(dǎo)致光譜發(fā)生變化。由此我們推斷該提取液可能含黃酮類物質(zhì)。

圖1 竹子黃酮提取物的紫外/可見光譜

1.2.3 總黃酮的測定

NaNO2-Al(NO3)3顯色法:取1 mL樣品置于10 mL的比色管中，用70%的乙醇補(bǔ)充至5 mL，加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，搖勻，放置5 min后，加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液，搖勻，放置6 min后加入2 mL 1 mol·L-1NaOH溶液，并用30%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置10 min，500 nm波長處分光光度計比色法測定。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取蘆丁對照品0.010 0 g，置于小燒杯中，加70%乙醇溶液溶解后，移入100 mL容量瓶中，用乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻備用 (濃度為1.000 0 mg·mL-1)。

分取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL分別置于10 mL的比色管中，同時作空白。NaNO2-Al(NO3)3顯色法在波長500 nm處測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的評價

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.100～0.600 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，線性回歸方程為 D=1.098 9 C+0.001 5，R2=0.999 7。

2.1.2 精密度

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液3.0 mL，同一樣品溶液1.0 mL各5份，同標(biāo)準(zhǔn)曲線操作和樣品測定的操作，測定吸光度值。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的RSD=0.25%，樣品吸光度值的RSD=0.50%，說明精密度良好 (表1)。

表1 各樣品的吸光度值

2.1.3 穩(wěn)定性

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液3.0 mL，同一樣品溶液1.0 mL，同標(biāo)準(zhǔn)曲線操作和樣品測定的操作，在0、15、30、45、60、90 min測定其吸光度值，結(jié)果 (表2)表明，標(biāo)準(zhǔn)品在90 min內(nèi)穩(wěn)定，樣品在45 min基本內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 樣品加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確吸取樣品溶液1.0 mL，分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 0.25、0.5、1.0 mL，按實(shí)驗(yàn)方法測定吸光度，計算黃酮總量及回收率，結(jié)果 (表3)表明，該方法測定的結(jié)果比較準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表2 各樣品不同時間的吸光度值

表3 各樣品的加標(biāo)回收率

表4 正交試驗(yàn)的因素及水平

2.2 提取條件的選擇

2.2.1 取溶劑

據(jù)文獻(xiàn)報道［8-12］，竹葉黃酮一般為黃酮苷元難溶或不溶于水，易溶于醇類、氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑或堿，根據(jù)它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及物理和化學(xué)性質(zhì)確定提取溶劑。利用甲醇、50%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯等不同溶劑提取 (2.00 g竹粉，30 mL溶劑，提取1 h)，結(jié)果D值分別為0.490，0.460，0.360，0.300和 0.320。其中甲醇的浸出效果最好，乙醇次之，丙酮和乙酸乙酯較差。這可能與溶劑的分子量小，極性大，容易滲透植物細(xì)胞壁等因素有關(guān)［13］。對于甲醇和乙醇比較而言，乙醇毒性更小，更安全，價格便宜，也易于回收，因此選用乙醇作浸提溶劑。

2.2.2 提取條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時間等4個因素，分別在各因素最佳條件前后各取1點(diǎn)組成3個水平，以提取物的吸光度為試驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計，試驗(yàn)因素水平見表4。

根據(jù)表5的值分析可知，最好的試驗(yàn)組合為A2 B2 C3 D1，即最佳提取條件為:液料比1∶15，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取溫度為80℃和提取時間為1 h。由極差R值可以看出，對提取效果影響最大的是因素A(液料比)，其次是因素B(乙醇體積分?jǐn)?shù))和因素C(提取溫度)，最小的是因素D(提取時間)。因此，在進(jìn)行竹粉黃酮提取時，要對提取液料比和乙醇濃度加以嚴(yán)格控制，同時也要考慮到提取溫度和時間。

表5 各處理組合的吸光度值

2.3 黃條金剛竹提取物的總黃酮含量

分別采用上述方法對2010年6月1日和2010年8月3日采自浙江農(nóng)林大學(xué)校竹種園同一采樣點(diǎn)的黃條金剛竹竹粉樣品進(jìn)行測定。結(jié)果如表6所示。竹葉中黃酮總量為 5.9 ～13.1 mg·g-1［14-15］。而我們測定黃條金剛竹竹粉樣品含量為4.46～7.19 mg·g-1，由于竹粉樣品含較多竹枝條，因此竹粉總黃酮含量比竹葉總黃酮含量略低。此外，從2次間隔2個月的采集樣品發(fā)現(xiàn)，新生黃條金剛竹竹粉中黃酮含量為6.10 mg·g-1略低與老竹竹粉的6.71%，且8月份黃條金剛竹竹粉總黃酮含量為6.10 mg·g-1，明顯高于6月份黃條金剛竹竹粉的4.46%，這與文獻(xiàn)報道［15］新生竹葉黃酮含量高的報道不符。我們認(rèn)為這可能是新生黃條金剛竹竹葉占整竹的比率較小所致。

表6 黃條金剛竹竹粉中總黃酮含量

由此可見，黃條金剛竹中具有較高的黃酮含量，由于黃條金剛竹生長速度快，其黃酮資源極具開發(fā)利用價值。

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)對黃條金剛竹竹粉中的總黃酮進(jìn)行了提取條件優(yōu)化和含量測定，并初步分析黃條金剛竹竹粉中總黃酮含量，為進(jìn)一步開發(fā)和利用黃條金剛竹資源的研究和評價提供了理論依據(jù)和檢測手段。

［1］ 周純芳.中國觀賞竹種簡介 ［J］.竹類研究，1993，7(49):68-87.

［2］ 王波，汪奎宏，李琴，等.黃條金剛竹生長規(guī)律研究［J］.浙江林業(yè)科技，2008，28(6):16-19.

［3］ 周芳純，高尚愚.日本竹林生產(chǎn)和利用情況考察報告［J］.竹類研究，1984，3(2):5.

［4］ 張英.天然功能性添加劑-竹葉提取物 ［J］.精細(xì)與專用化學(xué)品，2002，10(7):20-22.

［5］ 黃筱雄，蔣元淡，肖毓敏.竹子的綜合利用 ［J］.浙江林業(yè)科技，2003，23(4):99-102.

［6］ 朱宏莉，韋海洪，宋紀(jì)蓉，等.竹葉總黃酮的提取和純化工藝的研究 ［J］.食品科學(xué)，2005，26(8):158-161.

［7］ 李勇，宋慧.竹葉蛋白的分離提取及其副產(chǎn)物的利用［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(3):136-138.

［8］ 鄔建敏.竹葉黃酮化合物總量及蘆丁含量的測定 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998，40:339-343.

［9］ 許鋼，張虹，胡劍.竹葉中黃酮提取方法的研究 ［J］.分析化學(xué)，2000(7):857-859.

［10］ 宋秋燁，陳梅，吳啟南.淡竹葉中總黃酮提取工藝研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14(3):46-47.

［11］ 張英.天然功能性竹葉提取物:竹葉黃酮 ［J］.中國食品添加劑，2002(3):54-58.

［12］ 彭曉春.醇提一酯萃法提取竹葉中的總黃酮 ［J］.吉首大學(xué)學(xué)報:自科版，2003，24(2):87-89.

［13］ 李坤平，楊國恩，潘天玲，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)化竹葉總黃酮提取工藝研究 ［J］.廣州藥學(xué)院學(xué)報，2004，20(2):102-103.

［14］ 馮濤，曹東旭，呂曉玲.竹葉總黃酮含量的測定 ［J］.中國食品添加劑，2002(6):85-87.

［15］ 劉翠，王文久.竹葉資源研究進(jìn)展及開發(fā)利用 ［J］.林業(yè)建設(shè)，1999(6):10-14.