陶 勇，周 俊，任善茂，張紹祥，董曉君，高勤學(xué)

(1.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300;2.儀征市新集鎮(zhèn)獸醫(yī)站，江蘇 儀征 210095;3.淮安市楚州區(qū)獸醫(yī)站，江蘇 淮安 223200)

豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒 (Porcine endogenous retrovirus，PERV)是指以前病毒DNA形式整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞染色體復(fù)制而復(fù)制的反轉(zhuǎn)錄病毒，其在體外感染人源細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)引起了人們對異種移植安全性的廣泛關(guān)注［1-2］。實際上，這些內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒經(jīng)常包含有突變成分，有提供抵制感染的保護(hù)作用，并且涉及到繁殖 過 程。2007 年， TAMU (TEXAS A＆M University)一個研究小組發(fā)現(xiàn)綿羊en JSRVs對早期妊娠和受精卵著床具有重要作用，采用RNA干擾的方法，阻止en JSRVs基因的表達(dá)，會引起妊娠的終止［3］。我們以姜曲海豬為研究對象，檢測分析PERV囊膜基因env 3種通用基因型在姜曲海豬中存在情況，并進(jìn)一步分析不同基因型與姜曲海豬產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系，以期對姜曲海豬的開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 試驗豬

隨機(jī)選取有哺乳記錄的純種姜曲海豬60頭，采集耳組織樣，并收集每頭母豬的產(chǎn)仔記錄。

1.2 工具酶和試劑

Taq DNA聚合酶、蛋白酶K等購自Promega公司，DNA Marker DL2000購自大連寶生物公司(TaKaRa)。

1.3 耳組織DNA制備

耳組織采用USSTE裂解液與蛋白酶K消化，再用酚-氯仿抽提的方法制備DNA，DNA樣品溶于TE中，儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)目前通用的 PERV-env基因分型方法［4］，合成了3對用于分型檢測的引物 env-A、env-B、env-C。 序 列:env-AF:5'-TGGAAAGATTGGCAA CAGCG-3';env-AR:5'-AGTGAATGTTAGGCTCAG TGG-3';env-BF:5'-TTCTCCTTTGTCAATTCCGG-3';env-BR:5'-TACTTTATCGGGTCCCACTG-3';env-CF:5'-CTGACCTGGATTAGAACTGG-3';env-CR:5'-ATGTTAGAGGATGGTCCTGG-3'。

1.5 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)在10μL體系中進(jìn)行，在無菌指形管中依次加入 1μL 耳組織 DNA、10×buffer 1μL、25mmol·L-1MgCl21μL、dNTPs 混合物 (2.5mmol each)0.8μL、上下游引物 (50 pmol)各 0.4μL、Taq DNA聚合酶 (50 U·μL-1)0.1μL，加無菌去離子水至10μL。94℃預(yù)變性4min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸5min;4℃保溫。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳

用1×TBE電泳緩沖液制備2%瓊脂糖凝膠，加 EB 至終濃度 0.5μg·mL-1，取 3μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，加溴酚蘭混勻。以5 V·cm-1的電壓進(jìn)行電泳，用紫外透射儀分析擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果和分析

2.1 PCR的檢測結(jié)果

由圖1可見，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好，片段長度與所設(shè)計的片段大小一致。

各基因型頻率ABC為0.90(54個體數(shù))，AB為0.03(2個體數(shù))，AC為0.03(3個體數(shù))，O(PERV-env 3種亞型均未檢測到)為0.03(1個體數(shù))。絕大部分姜曲海豬個體內(nèi)均有 PERV-A、B、C型的存在，但有1個樣品未檢測到PERV-B型，1個樣品未檢測到PERV-C型，1個樣品3種亞型均未檢測到。

圖1 PERV-env 3種亞型PCR的檢測結(jié)果

2.2 不同基因型間產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系

由表1可知，在所統(tǒng)計的姜曲海豬胎次內(nèi)，AB、AC、O 3種基因型的產(chǎn)仔數(shù)高于ABC型的產(chǎn)仔數(shù)。PERV的存在可能有降低豬產(chǎn)仔數(shù)的趨勢。

表1 PERV-env基因型間的產(chǎn)仔數(shù)

3 小結(jié)和討論

檢測結(jié)果顯示，在姜曲海豬所有被檢樣品中，絕大部分個體均存在PERV-env的3種類型，這與有關(guān)文獻(xiàn)報一致［5-6］。但潘漢世［7］在廣西巴馬小型香豬群體中卻沒有發(fā)現(xiàn)C亞型，這可能與廣西巴馬小型香豬是由于長期近親交配形成的封閉群體有關(guān)。

PERV對豬繁殖性能的影響至今尚未見相關(guān)報道。但中國農(nóng)業(yè)大學(xué)［8］的研究表明，繁殖力高的豬品種如梅山豬其PERV拷貝數(shù)普遍高于其他品種，這是否意味著PERV在豬繁殖過程中起著重要的作用。本試驗分析了PERV-env基因型對產(chǎn)仔數(shù)的影響，結(jié)果表明，PERV-env 3種亞型中，缺失型個體的產(chǎn)仔數(shù)高于3種亞型全檢出的個體。由于條件限制，本試驗中所檢測的姜曲海豬個體數(shù)還較少，可靠性較低，今后可以在此研究基礎(chǔ)上擴(kuò)大檢測群體或其他地方品種豬上來驗證這個結(jié)果。

［1］Patience C，Takeuchi Y，Weiss R A.Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs［J］.Nat Med，1997，3(3):282-286.

［2］Joachim Denner.Recombinant porcine endogenous retroviruses(PERV-A/C):a new risk for xenotransplantation ［J］.Arch Virol，2008，153:1421-1426.

［3］Jonsson S R.，LaRue R S.The restriction of zoonotic PERV transmission by human ［J］.APOBEC3G PLoS ONE，2007，2(9):893.

［4］Sarah K P，David A M，Peter J M，et al.Transient transmission of porcine endogenous retrovirus to fetal lambs after pig islet tissue xenotransplantation ［J］.Immunology and Cell Biology，2007，85:238-248.

［5］徐斯日古楞，呂茂民，吳健敏，等.中國巴馬小型豬中豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的檢測 ［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2003，24(6):79-81.

［6］Bosch S，Arnauld C，Jestin A.Study of full length porcine endogenous retrovirus genomes with envelope gene polymorphism in a specific-pathogen-free large white swine herd ［J］.Jviol，2000，74(18):8575.

［7］潘漢世.廣西巴馬小型豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的檢測及分子生物學(xué)特性的研究 ［D］.南寧:廣西大學(xué)，2007.

［8］Li Z，Ping Y.Phylogenetic analysis of porcine endogenous retrovirusesexpressed in Chinese pigs based on envelope sequences ［J］.Transplant Proc，2006，38(7):2252-2257.