芮云鋒，陳小龍，熊智強(qiáng)，李 偉

(浙江工業(yè)大學(xué)，浙江 杭州 310032)

油菜菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum)也稱為油菜核盤菌，是一種世界性病原真菌［1］。在中國(guó)，油菜菌核病居油菜3大病害之首，重病年減產(chǎn)達(dá)50%，嚴(yán)重影響了我國(guó)的油菜生產(chǎn)［2］，雖然國(guó)內(nèi)外在該病害的發(fā)生和流行規(guī)律及預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)等方面做了大量的研究工作［3-4］。在藥劑和農(nóng)業(yè)栽培措施防治等方面也取得了一定的成績(jī)，但仍未從根本上改變油菜菌核病嚴(yán)重危害的局面［5］。

馬來(lái)酸酐結(jié)構(gòu)天然化合物是一類由微生物產(chǎn)生的物質(zhì)，已報(bào)道的該類化合物絕大部分都具有良好的生物活性，特別是殺菌活性［6］。比如變構(gòu)霉素，抗真菌效果明顯，尤其對(duì)油菜菌核病 (EC50=0.5 μg·mL-1)［7］。本課題組發(fā)現(xiàn)由馬來(lái)酸酐結(jié)構(gòu)為先導(dǎo)的合成含馬來(lái)酸酯類結(jié)構(gòu)的化合物也有較好的抑菌活性，尤其對(duì)真菌的抑制效果良好，特別是馬來(lái)酸乙丙酯，對(duì)油菜菌核病菌的半抑制濃度和最小抑制 濃 度 分 別 為 278.90 μg·mL-1、480.61 μg·mL-1［8］。馬來(lái)酸酯類化合物本身具有合成工藝簡(jiǎn)單，原料便宜，對(duì)人體毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。馬來(lái)酸酯類物質(zhì)含馬來(lái)酸酐結(jié)構(gòu)，在醫(yī)藥和食品防霉等方面已成功應(yīng)用，本課題組合成變構(gòu)霉素等含馬來(lái)酸酐結(jié)構(gòu)的化合物對(duì)油菜菌核病菌的抑制效果良好。本研究合成了一批含馬來(lái)酸酐結(jié)構(gòu)的馬來(lái)酸酯類物質(zhì)，并檢測(cè)其對(duì)油菜菌核病菌的抑制活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 化合物

馬來(lái)酸酐購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純。甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、濃硫酸、硫酸氫鈉、無(wú)水硫酸鈉、碳酸氫鈉等試劑購(gòu)于本地試劑供應(yīng)商，分析純。

1.1.2 供試菌株

油菜菌核病菌 (Sclerotinia scerotiorum)，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g切成小塊，500 mL水煮沸30 min，過(guò)濾液中加葡萄糖20 g，瓊脂條20 g，加熱溶化，加蒸餾水至1 000 mL，pH值自然，分裝，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 馬來(lái)酸單酯類化合物的合成

馬來(lái)酸酐和過(guò)量的醇一起裝在三角瓶中，振蕩反應(yīng)3 h，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除多余的醇類，得到馬來(lái)酸單酯，加無(wú)水硫酸鈉干燥保存。反應(yīng)過(guò)程中用薄板層析來(lái)檢測(cè)馬來(lái)酸單酯的反應(yīng)進(jìn)程，展開(kāi)劑為丙酮︰三氯甲烷1∶3。該反應(yīng)過(guò)程中馬來(lái)酸酐開(kāi)環(huán)結(jié)合一分子水，因此反應(yīng)較迅速，也無(wú)需催化劑(圖 1)。

1.2.2 馬來(lái)酸二酯類化合物的合成

圖1 馬來(lái)酸單酯的合成

馬來(lái)酸單酯與過(guò)量的醇一起放入燒杯中，在濃硫酸或硫酸氫鈉等催化劑的催化作用下，回流反應(yīng)3 h，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去多余的醇類和反應(yīng)產(chǎn)生的水，得到的馬來(lái)酸二酯用5%的碳酸氫鈉溶液萃取去除酸性催化劑，加無(wú)水硫酸鈉干燥保存。反應(yīng)過(guò)程中用薄板層析來(lái)檢測(cè)馬來(lái)酸二酯的反應(yīng)進(jìn)程，展開(kāi)劑為丙酮︰三氯甲烷1∶3(圖2)。

圖2 馬來(lái)酸二酯的合成

1.2.3 菌種活化

將浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的油菜菌核病(Scleotinia sclerotiorum)菌株進(jìn)行活化，用打孔器將保藏的油菜菌核病菌轉(zhuǎn)接到倒有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d，冰箱保存待用。

1.2.4 各馬來(lái)酸酯類化合物對(duì)油菜菌核病菌的最小抑制濃度 (MIC)測(cè)定

將合成的各馬來(lái)酸酯類化合物分別稀釋至10、50、100、500、1 000 mg·mL-1等不同濃度，121℃，20 min滅菌。

在無(wú)菌條件下，移取1 mL各濃度馬來(lái)酸酯類化合物加入培養(yǎng)皿中，趁熱倒入熔化的PDA培養(yǎng)基9 mL于上述培養(yǎng)皿中，混勻后冷卻。用打孔器將活化的菌核病菌轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)皿上，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。

每隔12 h觀察培養(yǎng)結(jié)果，記錄抑菌圈的大小。按上述方法對(duì)濃度梯度適當(dāng)調(diào)整，直到找到MIC。

1.2.5 各馬來(lái)酸酯類化合物的生物活性測(cè)定

在無(wú)菌條件下，分別取1 mL各濃度的馬來(lái)酸酯類化合物加入培養(yǎng)皿中，趁熱倒入熔化的PDA培養(yǎng)基9 mL于上述培養(yǎng)皿中，混勻后冷卻，以無(wú)菌水為空白對(duì)照。

凝固后，用同一個(gè)打孔器分別移接生長(zhǎng)一致的菌塊，菌絲面朝下，置于培養(yǎng)皿中央。每皿接1個(gè)菌塊，每次做3個(gè)平行樣。于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。48 h后測(cè)量菌落直徑，十字交叉，取兩次數(shù)據(jù)平均值，并計(jì)算抑菌率。

抑菌率/%=(對(duì)照菌落純生長(zhǎng)量-處理菌落純生長(zhǎng)量)/對(duì)照菌落純生長(zhǎng)量×100。

菌落純生長(zhǎng)量/mm=2次直徑平均值 -菌塊直徑。

然后以合成的各馬來(lái)酸二酯類化合物濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，確定EC50和MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬來(lái)酸酯類物質(zhì)的合成

本實(shí)驗(yàn)以馬來(lái)酸酐為起始原料，化學(xué)合成了馬來(lái)酸單甲酯、馬來(lái)酸二乙酯、馬來(lái)酸甲丙酯、馬來(lái)酸乙丁酯等14種馬來(lái)酸酯類物質(zhì) (圖3)。

2.2 合成反應(yīng)時(shí)間對(duì)馬來(lái)酸單酯類物質(zhì)合成的影響

在馬來(lái)酸單酯類物質(zhì)的合成過(guò)程中，反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響了合成的效果，實(shí)驗(yàn)中以馬來(lái)酸單乙酯為標(biāo)本來(lái)確定馬來(lái)酸單酯類物質(zhì)的最佳反應(yīng)時(shí)間。取6份5 g馬來(lái)酸酐和20 mL無(wú)水乙醇于28℃、100 r·min-1條件下分別反應(yīng) 1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h，反應(yīng)結(jié)束后得到的馬來(lái)酸單乙酯分別為:6.86 g、7.49 g、8.01 g、8.34 g、8.48 g、8.48 g。

以上數(shù)據(jù)結(jié)合薄板層析，可知馬來(lái)酸單乙酯在3 h后已經(jīng)反應(yīng)完全，因此，我們?cè)谝院蟮膶?shí)驗(yàn)中合成馬來(lái)酸單酯類物質(zhì)的反應(yīng)時(shí)間都設(shè)定為3 h。

2.3 馬來(lái)酸酐和醇的數(shù)量關(guān)系對(duì)馬來(lái)酸單酯類物質(zhì)合成的影響

在馬來(lái)酸單酯的合成中，馬來(lái)酸酐和醇類的數(shù)量關(guān)系將影響合成效果，實(shí)驗(yàn)中以馬來(lái)酸單乙酯的合成為標(biāo)本來(lái)確定反應(yīng)中馬來(lái)酸酐和醇類的數(shù)量關(guān)系。在1 mol無(wú)水乙醇中分別加0.3 mol、0.5 mol、0.7 mol、0.9 mol 、1.0 mol、1.1 mol、1.2 mol、1.3 mol等8種不同摩爾數(shù)的馬來(lái)酸酐，反應(yīng)3 h后得到的馬來(lái)酸單乙酯的量分別為:0.25 mol、0.37 mol、0.57 mol、0.82 mol、0.87 mol、0.91 mol、1.23 mol、1.35 mol。

觀察以上數(shù)據(jù)可知，馬來(lái)酸單乙酯的量隨著馬來(lái)酸酐的量的增加而增加。但是，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中馬來(lái)酸酐超過(guò)1.0 mol的3個(gè)燒瓶中殘留有未溶的馬來(lái)酸酐，而且馬來(lái)酸酐能溶于無(wú)水乙醇，用薄板層析法可以發(fā)現(xiàn)，部分馬來(lái)酸酐只是溶解在無(wú)水乙醇中，并未參加反應(yīng)?？紤]到最佳反應(yīng)效果和經(jīng)濟(jì)效率，實(shí)驗(yàn)采取醇過(guò)量的方法，在以后的實(shí)驗(yàn)中醇和馬來(lái)酸酐的摩爾比都設(shè)定為1∶0.9。

圖3 合成的各種馬來(lái)酸酯類物質(zhì)

2.4 馬來(lái)酸酯類化合物對(duì)菌核病菌的抑制作用

加有各濃度的馬來(lái)酸酯類物質(zhì)的油菜菌核病菌放于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，48 h后測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率，作圖確定半抑制濃度 (EC50)和最小抑制濃度 (MIC)，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 馬來(lái)酸單酯類物質(zhì)的半抑制濃度 (EC50)和最小抑制濃度 (MIC)

從以上數(shù)據(jù)可以得出，馬來(lái)酸單酯類物質(zhì)對(duì)油菜菌核病菌的抑制效果基本上是隨著酯鍵上碳鏈的伸長(zhǎng)而增加。其中，馬來(lái)酸單丙酯的半抑制效果最好，EC50=479.61 μg·mL-1，馬來(lái)酸單丁酯的最小抑制效果最好，MIC=1 073.80 μg·mL-1。

表2 馬來(lái)酸二酯類物質(zhì)的半抑制濃度 (EC50)和最小抑制濃度 (MIC)

以上數(shù)據(jù)可以得出，馬來(lái)酸二酯類物質(zhì)對(duì)油菜菌核病菌的抑制效果基本上也是隨著酯鍵上碳鏈的伸長(zhǎng)而增加。其中，馬來(lái)酸乙丙酯的抑菌活性最好，EC50=278.90 μg·mL-1，MIC=480.61 μg·mL-1。

比較表1和表2我們認(rèn)為，馬來(lái)酸二酯類物質(zhì)對(duì)油菜菌核病菌的抑制效果普遍比馬來(lái)酸單酯類物質(zhì)要好。

3 小結(jié)與討論

關(guān)于馬來(lái)酸酯類物質(zhì)的合成研究較多，如王天貴等［9-11］前后3次研究過(guò)馬來(lái)酸二甲酯的合成新工藝，虞丹等［12］研究過(guò)酸性功能化離子液體催化合成馬來(lái)酸二乙酯。但國(guó)內(nèi)外學(xué)者僅限于單個(gè)馬來(lái)酸酯類物質(zhì)的研究，本實(shí)驗(yàn)首次成批合成馬來(lái)酸酯類物質(zhì)，并首次把馬來(lái)酸酯類化合物應(yīng)用于防治油菜菌核病害［8］。研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)中化學(xué)合成的14種馬來(lái)酸酯類化合物均有抑油菜菌核病菌效果。目前世界上已報(bào)道的馬來(lái)酸酐類天然化合物只有27個(gè)，其中大部分都具有十分良好的殺菌活性［13］，結(jié)合我們的研究，可以推測(cè)馬來(lái)酸酐結(jié)構(gòu)是這些化合物具有良好殺菌活性的基礎(chǔ)。

目前，馬來(lái)酸酯類物質(zhì)在醫(yī)藥和食品防霉方面已成功應(yīng)用。段保民［14］用富馬酸單甲酯做食品防腐劑，樊素芳等［15］合成了新型食品飼料防霉劑富馬酸二甲酯，以上工作顯示了馬來(lái)酸酯類物質(zhì)是一類低毒或無(wú)毒、易被環(huán)境降解的化合物，因此有望進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出一類極具應(yīng)用價(jià)值的新型抗菌核病的農(nóng)藥，有開(kāi)發(fā)成為綠色農(nóng)藥的前景。

本研究只是初步探討了馬來(lái)酸酯類物質(zhì)的抑菌活性，也只對(duì)油菜菌核病菌的抑菌效果做了研究，還可對(duì)其他菌種做相關(guān)抑菌實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)馬來(lái)酸酯類物質(zhì)的抑制機(jī)理沒(méi)有深入研究，在研究菌核病菌的生長(zhǎng)曲線，分析具體抑制機(jī)理過(guò)程中，還可對(duì)含馬來(lái)酸酯類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)上的改造，分析其區(qū)別所在，找到抑菌效果更佳的馬來(lái)酸酯類物質(zhì)或其衍生物。

［1］ Boland G J，Hall R. Index of plant hosts of Sclerotinia sclerotiorum ［J］.Plant Pathol，1994，(16):93-108.

［2］ 張夕林，孫雪梅，張谷豐，等.油菜菌核病抗藥性監(jiān)測(cè)與綜合治理技術(shù)的研究 ［J］.農(nóng)藥科學(xué)與管理，2003，24(6):145-149.

［3］ 張彭湃.微生物菌種選育技術(shù)的發(fā)展與研究進(jìn)展 ［J］.生物學(xué)教學(xué)，2005.30(9):3-5.

［4］ 廖曉蘭，羅寬.油菜花上細(xì)菌的分離及其對(duì)菌核菌的拮抗作用 ［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，26(4):202-211.

［5］ 朱小惠，陳小龍.油菜菌核病的致病機(jī)理和生物防治［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，5:1035-1038.

［6］ Xiaolong Chen，Yuguo Zheng and Yinchu Shen Natural products with maleic anhydride structure:Nonadrides，tautorrIycin， chaetomdlic aahyaride， and other compounds［J］，Chem Rev，2007，107:1777-1830.

［7］ Cheng XC，Kihara T，Kusakabe H，et al.A new antibiotic，tautomycin. Journal of Antibiotics， 1987， 40 (6):907-909.

［8］ 陳小龍，芮云鋒.順丁烯二酸酯類化合物對(duì)油菜菌核病菌的抑制 ［P］.201010122276.9，2010.

［9］ 王天貴，余錫孟.馬來(lái)酸二甲酯合成新工藝研究:I催化劑制備 ［J］.化學(xué)工程師，2010，173(2):8-12.

［10］ 王天貴，李強(qiáng)，余錫孟.馬來(lái)酸二甲酯合成新工藝研究:II酯化反應(yīng)條件研究 ［J］.化學(xué)工程師，2010，174(3):3-6.

［11］ 王天貴，李強(qiáng)，余錫孟.馬來(lái)酸二甲酯合成新工藝研究:III:鐵、鎂改性沸石催化酯化反應(yīng)研究 ［J］.化學(xué)工程師，2010，175(4):13-16.

［12］ 虞丹，郭紅云.酸性功能化離子液體催化合成馬來(lái)酸二乙酯 ［J］.工業(yè)催化，2009，17(8):62-65.

［13］ 金侃華，陳小龍.含順丁烯二酸酐結(jié)構(gòu)化合物抑制黑曲霉性能的研究 ［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(21):9857-9858.

［14］ 段保民.新食品防腐劑富馬酸單甲酯的制備 ［J］.應(yīng)用化工，1990(1):40-41.

［15］ 樊素芳，徐翠蓮，王彩霞，等.新型食品飼料防霉劑富馬酸二甲酯的一鍋合成法 ［J］.鄭州糧食學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，21(2):38-40.