張 麗，吳梅香**，羅 佳，張靈玲，黃雪峰，尤梅蘋，范青海

（1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

厲眼蕈蚊 （Lycoriella sp.）隸屬于雙翅目 （Diptera）、長(zhǎng)角亞目 （Nematocera）、 眼蕈蚊總科 （Sciaroidea）、 眼蕈蚊科 （Sciaridea）， 其中平菇厲眼蕈蚊 （Lycoriella pleuroti Yang et Zhang）是我國(guó)危害食用菌的優(yōu)勢(shì)種[1]。厲眼蕈蚊主要以幼蟲取食菌絲、菇蕾以及鉆蛀菌柄進(jìn)行為害，并能分解菌料中的有效成分，導(dǎo)致菇體萎縮；成蟲雖不取食，但能夠傳播食用菌病害和害螨[2]。目前，食用菌生產(chǎn)上防治厲眼蕈蚊最普遍的方法是化學(xué)防治。然而，化學(xué)藥劑存在藥劑殘留和害蟲抗藥性等多種副作用，尤其是藥劑殘留問題在生長(zhǎng)周期較短的食用菌上尤為突出。物理防治目前還無法有效控制害蟲發(fā)生。因此，生物防治愈來愈成為食用菌害蟲防治方法研究的焦點(diǎn)。蘇云金芽孢桿菌 （Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt）是研究最多、應(yīng)用最廣的一類殺蟲微生物。由于其分布極廣，且不同菌株間殺蟲譜及殺蟲活性存在差異，因此，通過對(duì)各種Bt菌株進(jìn)行活性測(cè)試，篩選對(duì)食用菌害蟲具有高活性和特異殺蟲活性的菌株，對(duì)將來實(shí)施食用菌害蟲的無害化防治具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 供試蟲源

供試厲眼蕈蚊采自福州金山福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心長(zhǎng)根菇廢棄菌袋。飼養(yǎng)方法參考王梓清的簡(jiǎn)易大量飼養(yǎng)方法[3]，以山藥為替代飼料進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 Bt菌株和培養(yǎng)基

1.2.1 Bt菌株

供試的46個(gè)菌株，由福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物農(nóng)藥研究室提供。

1.2.2 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化鈉10 g、 瓊脂粉 17 g， 蒸餾水 1 000 mL， pH 7.0～7.2， 分裝后滅菌。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化鈉10 g， 蒸餾水 1 000 mL， pH 7.0～7.2， 分裝后滅菌。

PM發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母膏2 g、KH2PO40.1 g、 FeSO4·7H2O 0.02 g、 ZnSO4·7H2O 0.02 g、 MgSO4·7H2O 0.30 g、 MnSO4·H2O 0.0328 g， 水 1 000 mL， pH 7.0～7.2，分裝后滅菌。

1.3 菌株發(fā)酵液制備

在無菌條件下，將保藏的甘油菌按100∶1的接種量接于 5 mL的 LB試管液體培養(yǎng)基中， (30±1)℃、 220 r·min－1搖床培養(yǎng)，24 h后按同樣的接種量轉(zhuǎn)接于PM發(fā)酵培養(yǎng)基中， (30±1)℃、 220 r·min－1搖床培養(yǎng)， 72 h 后進(jìn)行生測(cè)。

1.4 供試Bt菌株胃毒活性測(cè)定

參考慕衛(wèi)韭菜遲眼蕈蚊的生測(cè)方法及防治藥劑研究[4]，采用浸漬山藥飼喂法測(cè)定供試Bt菌株對(duì)厲眼蕈蚊7日～8日齡幼蟲的毒力。將山藥切成大小一致的薄片 （厚約2 mm～3 mm），在Bt發(fā)酵液中浸30 min后放入直徑6 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部放入1層濾紙用以保濕，然后挑入?yún)栄坜ξ糜紫x，20頭/皿。以山藥浸入未接菌的PM發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理重復(fù)3次，于25℃、相對(duì)濕度85%的條件下飼養(yǎng)，48 h后在顯微鏡下觀察死亡蟲數(shù)，計(jì)算死亡率和校正死亡率。校正死亡率達(dá)50%以上作為初篩有效菌株[5]，之后對(duì)初篩有效菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.5 菌株復(fù)篩

1.5.1 發(fā)酵液原液濃度

用平皿計(jì)數(shù)法計(jì)算初篩有效菌株發(fā)酵液原液的活菌數(shù)。具體做法：在無菌條件下，將菌株發(fā)酵液原液經(jīng)一系列稀釋，然后用移液器移取10－6的稀釋菌液0.2 mL放入無菌平皿，再倒入適量的已熔化并冷卻的LB培養(yǎng)基，與菌液混勻，重復(fù)4次，冷卻后放入 (30±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中，24 h后計(jì)數(shù)，計(jì)算出每毫升菌株發(fā)酵液原液的活菌數(shù)，計(jì)算公式如下：

式中：N1為平皿菌落平均數(shù)；n為稀釋倍數(shù)。

1.5.2 復(fù)篩

在預(yù)試的基礎(chǔ)上，分別將初篩有效菌株發(fā)酵液原液依次稀釋為5個(gè)濃度，然后對(duì)不同濃度的菌液進(jìn)行活性測(cè)定，方法同初篩。48 h后開始檢查結(jié)果，連續(xù)觀察4 d，根據(jù)96 h后的觀察結(jié)果，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，求出毒力回歸方程及LC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果

將46株Bt菌株分別感染厲眼蕈蚊7日～8日齡幼蟲，48 h后觀察，發(fā)現(xiàn)BRC－LLP29和IPS82兩個(gè)菌株為初篩有效菌株，校正死亡率分別達(dá)到了87.93%和70.21%，見表1。

感染Bt的厲眼蕈蚊幼蟲食欲減退，對(duì)毛筆觸動(dòng)反應(yīng)遲鈍，有腹瀉現(xiàn)象，死亡后蟲體變暗，輕觸易破。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，剛挑入浸有Bt發(fā)酵液的山藥片上的厲眼蕈蚊幼蟲會(huì)迅速爬離山藥片，24 h觀察時(shí)，大部分幼蟲才會(huì)鉆入山藥片中或隱藏于山藥片與濾紙片之間，而對(duì)照中挑入的厲眼蕈蚊幼蟲不爬離山藥片。推測(cè)可能是因?yàn)閰栄坜ξ糜紫x對(duì)部分Bt菌株發(fā)酵液本身的氣味有一段適應(yīng)過程。

表1 厲眼蕈蚊高活性Bt菌株的初步篩選

2.2 復(fù)篩結(jié)果

對(duì)初篩有效菌株BRC－LLP29和IPS82進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 厲眼蕈蚊有效Bt菌株的室內(nèi)毒力測(cè)定

從表2得出處理96 h后，BRC－LLP29菌株對(duì)厲眼蕈蚊的LC50為 1.182×108cfu·mL－1， IPS82 為 1.977×108cfu·mL－1，由此可見，BRC－LLP29菌株對(duì)厲眼蕈蚊的活性高于IPS82菌株。

3 討論

菌株篩選是發(fā)現(xiàn)厲眼蕈蚊高活力Bt菌株的重要手段。通過菌株篩選，發(fā)現(xiàn)了2株對(duì)厲眼蕈蚊幼蟲有高活性的菌株 （IPS82和BRC－LLP29菌株）， 其中BRC－LLP29菌株的活性高于IPS82菌株。IPS82菌株為蘇云金芽孢桿菌以色列亞種，該亞種是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)對(duì)雙翅目蚊蟲有強(qiáng)殺蟲活性的Bt菌株[6]。在食用菌害蟲防治上，國(guó)外在上世紀(jì)九十年代已有應(yīng)用Bt菌株防治蘑菇金翅厲眼蕈蚊的研究。1990年，White和Jarret以蘑菇金翅厲眼蕈蚊為試蟲，對(duì)IPS82和GC315兩個(gè)菌株進(jìn)行了毒力測(cè)定，結(jié)果二者的LC50分別為 130 mg·kg－1和 31.4 mg·kg－1， 且田間試驗(yàn)結(jié)果表明GC315的殺蟲效果與化學(xué)殺蟲劑除蟲脲相當(dāng)[7]。White等通過菌株篩選，又發(fā)現(xiàn)了對(duì)金翅厲眼蕈蚊有活性的GC327菌株，該菌株的殺蟲效果與化學(xué)殺蟲劑一樣，而且沒有副作用，因此，對(duì)該菌株進(jìn)行了半商業(yè)化試驗(yàn)[8]。由此可以看出，這兩個(gè)菌株的殺蚊效果均已超過了以色列亞種。我國(guó)于1979年從國(guó)外引進(jìn)以色列亞種[9]，至今在應(yīng)用方面也僅限于對(duì)水生蚊蟲的防治。

在食用菌害蟲的生物防治研究中，有應(yīng)用Bt防治食用菌害蟲的嘗試，蔣時(shí)察等在Bt菌株對(duì)平菇癭蚊的防效試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用生物農(nóng)藥Bt7216固體菌粉與少量菊酯類農(nóng)藥復(fù)配可以取得較好的防治效果[10]，但該試驗(yàn)并未說明單獨(dú)應(yīng)用Bt菌株后的防效。本實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)條件下對(duì)Bt菌株發(fā)酵液進(jìn)行毒力測(cè)定得出的結(jié)果，認(rèn)為BRC-LLP29菌株在濃度較高的情況下對(duì)厲眼蕈蚊有較好的控制效果，且其殺蟲效果亦超過了以色列亞種的IPS82菌株。但其作用緩慢，殺蟲速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)比不上吡蟲啉、阿維菌素等化學(xué)殺蟲劑。因此，今后應(yīng)該在菌株基因改造、工程菌構(gòu)建以及與其他殺蟲劑混配等多個(gè)方面進(jìn)行深入研究，以提高其殺蟲效果，同時(shí)，考慮到食用菌是真菌，故有必要在Bt菌株對(duì)食用菌生長(zhǎng)的影響方面做進(jìn)一步研究。

[1]張學(xué)敏，楊集昆，譚琦.食用菌病蟲害防治[M].北京：金盾出版社，1994.

[2]沈登榮，張宏瑞，張?zhí)?我國(guó)食用菌眼蕈蚊的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)食用菌，2008，27(1)：48-50.

[3]王梓清，羅佳，王伯明，等.厲眼蕈蚊簡(jiǎn)易大量飼養(yǎng)方法[J].中國(guó)食用菌，2008，27(5)：52-53.

[4]慕衛(wèi)，丁中，何茂華，等.韭菜遲眼蕈蚊的生測(cè)方法及防治藥劑研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 2002， 17(增刊)： 12-16.

[5]張靈玲，林晶，駱蘭，等.葉面分離Bt及對(duì)茶樹主要害蟲高毒力菌株的篩選[J].茶葉科學(xué)，2005，25(1)：56-60.

[6]趙新民，夏立秋，王發(fā)祥，等.殺蚊蘇云金芽孢桿菌及其晶體蛋白研究進(jìn)展[J].昆蟲知識(shí)，2007，44(3)：337-342.

[7]White PF,Jarret P.Laboratory and field test with Bacillus thuringensis for the control of the mushroom sciarid Lycoriella auripila[C].Brighton Crop Protection Conference:Pests and Diseases,1990.

[8]White PF,Butt J,Pethybndge NJ,et al.The story of a strain:Development of GC327,a dipteran-active strain of Bacillus thuringiensis effective against the mushroom sciarid,Lycoriella auripila science and cultivation of edible fungi[J].The International Society for Mushroom Science,1995,14(2):499-506.

[9]喻子牛.蘇云金桿菌以色列變種在我國(guó)的研究[J].華中農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1982(6)：93-97.

[10]蔣時(shí)察，莊燕平.BT防治平菇癭蚊試驗(yàn)[J].長(zhǎng)江蔬菜，1994(1)：20.