姚 強，高興喜，宮志遠**，游魯蒙，任鵬飛，劉 巖，韓建東，任海霞

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，山東 濟南 250100；2.魯東大學生命科學學院，山東 煙臺 264025；3.青島農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山東 青島 266109）

桑黃 （Phellinus igniarius）是一種珍貴的大型藥用真菌，屬擔子菌亞門 （Basidiomycotina）、層菌綱 （Hymenomycetes）、 多孔菌目 （Polyporales）、 銹革孔菌科 （Hymenochaetacae）、 針層孔菌屬 （Phellinus）。 目前， 國際上公認桑黃是生物抗癌領(lǐng)域中效果最好的真菌[1]。現(xiàn)代藥理學研究表明，桑黃具有抑制腫瘤、提高免疫力、抗氧化、保肝護肝等多種藥用功效[2-5]，其關(guān)鍵藥效成分為多糖、三萜和黃酮類物質(zhì)[6]。目前，國際市場對桑黃需求很大，而野生桑黃資源幾近枯竭，桑黃的人工栽培也只在小規(guī)模上獲得成功，因此，采用液體發(fā)酵技術(shù)進行桑黃的規(guī)模化生產(chǎn)具有廣闊的前景[7]。

稀土元素由于其特殊的理化性質(zhì)，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)有著廣泛的應用。稀土元素不但能夠促進植物的生長，還能促進植物細胞次生代謝產(chǎn)物的合成[8，9]。近年來，稀土元素在食用菌生產(chǎn)上的應用也日漸廣泛，稀土元素 （或稀土微肥）能夠促進蒙古口蘑、杏鮑菇、靈芝等食用菌的菌絲生長，對紅菇多糖深層發(fā)酵也具有一定的促進作用[10-13]。目前，稀土元素在桑黃液體發(fā)酵上的應用研究還未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

桑黃 （P.igniarius）菌株購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌株編號：CGMCC 5.95。

稀土元素硝酸鑭、硝酸鈰、硝酸釹、硝酸鐠、硝酸鉺，購自天津市光復精細化工研究所。香蘭素購自上海生工生物工程服務有限公司，齊墩果酸標準品購自煙臺市藥品檢驗所，其它試劑為普通分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化與發(fā)酵培養(yǎng)

將桑黃斜面菌種在PDA平板上活化，25℃培養(yǎng)7 d左右，待長滿平板后，用打孔器打取菌塊接種于200 mL PDB培養(yǎng)基，25℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)5 d~7 d，制備液體菌種用于下一步發(fā)酵實驗。

分別配制含有各稀土元素濃度梯度為0、0.001mmol·L-1、0.01 mmol·L-1、 0.1 mmol·L-1、 1.0 mmol·L-1的 PDB 培養(yǎng)基（500 mL三角瓶裝液量200 mL），每個濃度3個重復，高壓蒸汽滅菌。然后按5%的接種量將桑黃種子液接入各培養(yǎng)基中，置于25℃、150 r·min-1的搖床中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為7 d左右。

1.2.2 桑黃生物量的測定

發(fā)酵結(jié)束后收集菌絲體，并用去離子水洗滌菌體3次，65℃烘干至恒重后測量干重。

1.2.3 活性物質(zhì)的提取與檢測

多糖的提取與檢測按文獻 [14]方法進行。

三萜的提取與檢測按文獻 [15]方法進行。

黃酮的提取與檢測按文獻 [16]方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀土元素對桑黃生物量的影響

將稀土元素用于桑黃的液體發(fā)酵，在一定程度上可促進其生物量的積累，結(jié)果如圖1所示。

從圖1中可以看出，在培養(yǎng)基中添加稀土元素鈰和鉺有利于桑黃生物量的提高，其中鈰在濃度0.01 mmol·L-1時誘導效果最好，此時桑黃菌體生物量達到最大值（5.85±0.14）g·L-1，比沒有添加稀土元素的對照組提高了23%，而稀土元素鉺在濃度為0.1 mmol·L-1時也表現(xiàn)出較好的誘導效果， 使桑黃菌體生物量達到 （5.34±0.45）g·L-1，比對照組提高了13%。相比較而言，其它幾種稀土元素對桑黃生物量未能表現(xiàn)出明顯的促進作用，甚至稀土元素釹還表現(xiàn)出一定的抑制作用，這表明稀土元素對桑黃生物量積累的影響與稀土元素的種類有關(guān)。

2.2 稀土元素對桑黃胞內(nèi)多糖生產(chǎn)的影響

不同稀土元素對桑黃胞內(nèi)多糖生產(chǎn)也產(chǎn)生了不同程度的影響，結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出，稀土元素鑭、鈰、釹在一定濃度下可以促進桑黃胞內(nèi)多糖的合成，提高胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量。桑黃胞內(nèi)多糖的合成對稀土元素鈰的作用比較敏感，鈰在較低濃度 （0.001 mmol·L-1）就明顯促進了胞內(nèi)多糖的合成，并在濃度為0.01 mmol·L-1時，桑黃胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達到 （737.86±2.71）mg·L-1， 比對照組提高了 34%； 而稀土元素釹和鑭只有在較高濃度時才表現(xiàn)出較強的誘導作用，分別在濃度0.1 mmol·L-1和 1.0 mmol·L-1時使桑黃胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量達到 （789.09±2.09）mg·L-1和 （760.80±1.31）mg·L-1，比對照組提高了45%和38%；稀土元素鐠和鉺對桑黃的胞內(nèi)多糖的合成不但沒有表現(xiàn)出促進作用，反而有明顯的抑制作用。

2.3 稀土元素對桑黃胞外多糖生產(chǎn)的影響

稀土元素對桑黃胞外多糖產(chǎn)量的影響見圖3。

稀土元素對桑黃胞外多糖合成的影響表現(xiàn)出與胞內(nèi)多糖類似的結(jié)果，從圖3可以看出對桑黃胞外多糖合成具有促進作用的稀土元素仍然是鑭、鈰和釹，而稀土元素鐠和鉺則表現(xiàn)出抑制作用。稀土元素鈰在濃度為0.01 mmol·L-1時， 桑黃胞外多糖產(chǎn)量達到最大值 （610.36±0.31）mg·L-1，比對照組提高了117.05%，而稀土元素鑭和釹在濃度為0.1 mmol·L-1時均表現(xiàn)出較好的誘導效果，分別使桑黃胞外多糖產(chǎn)量達到 （587.27±0.31）mg·L-1和 （477.38±0.91）mg·L-1，比對照組提高了108.84%和69.76%。

2.4 稀土元素對桑黃胞內(nèi)三萜生產(chǎn)的影響

稀土元素對桑黃胞內(nèi)三萜生產(chǎn)的影響見圖4。

圖4 不同稀土元素對桑黃胞內(nèi)三萜生產(chǎn)的影響

稀土元素對桑黃胞內(nèi)三萜合成的影響也因稀土元素種類和濃度的不同，呈現(xiàn)出不同的變化趨勢，由圖4可以看出，稀土元素鑭、鈰、釹在一定濃度下對桑黃胞內(nèi)三萜的代謝具有一定的促進作用，可提高胞內(nèi)三萜產(chǎn)量。其中稀土元素鈰在濃度為0.01 mmol·L-1時，桑黃胞內(nèi)三萜產(chǎn)量達到 最大 值 （10.70±2.92）mg·L-1， 比 對照 組 提 高 了27.25%；稀土元素鑭在濃度為0.001 mmol·L-1時，桑黃胞內(nèi)三萜的產(chǎn)量為 （104.86±1.02）mg·L-1， 比對照組提高了25.05%；稀土元素釹在濃度為0.01 mmol·L-1時，桑黃胞內(nèi)三 萜產(chǎn) 量為 （95.47±2.63）mg·L-1， 比 對 照 組 提 高13.86%。稀土元素鐠和鉺對桑黃的胞內(nèi)三萜的代謝，不但未表現(xiàn)出促進作用，反而有明顯的抑制作用。

2.5 稀土元素對桑黃胞外三萜生產(chǎn)的影響

稀土元素對桑黃胞外三萜生產(chǎn)的影響與胞內(nèi)三萜呈現(xiàn)不同的變化趨勢，結(jié)果見圖5。

從圖5可以看出，5種稀土元素鑭、鈰、釹、鑭、鉺在一定的濃度下對于桑黃胞外三萜物質(zhì)的代謝，均具有一定的促進作用。其中作用效果最好的為稀土元素鑭，在其濃度為 0.01 mmol·L-1時，胞外三萜產(chǎn)量達到最大值（88.99±0.89）mg·L-1， 比對照組提高了 4.08倍； 稀土元素釹和鐠也均在濃度為0.01 mmol·L-1時達到最佳誘導效果，分別使桑黃胞外三萜含量達到 （56.38±0.82）mg·L-1和（47.90±1.90）mg·L-1， 比對照組提高了 2.23倍和 1.75倍。稀土元素鈰和鉺對桑黃胞外三萜代謝有一定的促進作用，但促進作用不如上述3種元素顯著。

2.6 脂肪酸對桑黃黃酮類物質(zhì)生產(chǎn)的影響

桑黃是少有的可產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)的藥用真菌，不同脂肪酸對桑黃黃酮生產(chǎn)的影響見圖6。

從本實驗結(jié)果來看 （圖6所示），所考察的幾種稀土元素均對桑黃黃酮的合成表現(xiàn)出一定的誘導作用。其中稀土元素釹誘導效果最好，在濃度0.001 mmol·L-1使桑黃黃酮產(chǎn)量達到最大值 155.30 mg·L-1，比對照組提高了59.69%；其次，誘導效果較好的稀土元素分別為鉺、鈰和鐠， 并分別在濃度 0.001 mmol·L-1、 0.001 mmol·L-1和 0.01 mmol·L-1時達到最佳誘導效果，使黃酮產(chǎn)量分別達到147.80 mg·L-1、 139.40 mg·L-1和 134.70 mg·L-1。 稀土元素鑭也在濃度0.001 mmol·L－1時，對桑黃黃酮的生產(chǎn)表現(xiàn)出一定的促進作用，但誘導效果要較其它幾種稀土元素弱很多。

3 結(jié)論與討論

稀土元素在食用菌上的應用，最初是以稀土微肥的形式用于食用菌的栽培，用來提高食用菌產(chǎn)量和品質(zhì)[18，19]。近年來，人們將特定的稀土元素用于食用菌的液體發(fā)酵，以考察對其有效成分積累的影響[12，20]，并取得理想的實驗結(jié)果。本文將稀土元素用于桑黃的液體發(fā)酵，來考察對桑黃藥用成分合成的影響。實驗結(jié)果表明，稀土元素對桑黃生物量的積累以及活性成分合成的影響，與稀土元素的種類和濃度密切相關(guān)。綜合來看，稀土元素鈰和鉺有利于桑黃生物量的積累，而稀土元素鈰、釹和鑭則對桑黃胞外多糖、胞內(nèi)多糖和胞內(nèi)三萜的合成具有顯著的促進作用。雖然本文所考察的幾種稀土元素都對桑黃胞外三萜以及黃酮的合成具有一定的促進作用，但稀土元素鑭、釹和鐠對胞外三萜的誘導效果相對較好，而釹、鉺和鐠則對黃酮誘導效果相對較好。李增利在研究稀土元素對紅菇多糖液體發(fā)酵的影響時也得出了類似的結(jié)論[12]。相對于桑黃多糖等活性成分的生產(chǎn)，桑黃生物量對稀土元素的誘導作用不甚敏感，這與郭麗瓊[19]、李增利[12]的研究結(jié)果基本一致。

稀土元素的作用機制可能類似于激素，因其具有類似鈣的原子結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)，可通過激活相應的酶系統(tǒng)而發(fā)揮作用[9，12]。然而，當稀土元素的濃度過高時，會呈現(xiàn)類似重金屬離子的特性，并與膜蛋白結(jié)合抑制有關(guān)酶的活性[9]。本研究中，稀土元素鐠和鉺等對桑黃胞多糖、稀土元素鑭和釹對黃酮的合成表現(xiàn)出的抑制作用，可能正是緣于此。

D’Aquino在研究稀土元素對木霉菌的生長影響時發(fā)現(xiàn)，稀土元素對木霉菌生長的影響作用具有種的特異性，而且稀土元素混合使用還體現(xiàn)出協(xié)同作用效果[21]。在本研究中，不同的稀土元素對桑黃菌絲的生長以及活性物質(zhì)的積累誘導表現(xiàn)出不同的作用效果，可能也是由于稀土元素對桑黃發(fā)揮作用具有種的特異性。另外，本研究未考察稀土元素混合物對桑黃生長和活性物質(zhì)積累合成的影響，郭麗瓊[19]和張金桐[18]在研究稀土元素混合物 （稀土微肥）對靈芝生長和品質(zhì)影響時發(fā)現(xiàn)，稀土元素混合物能夠顯著促進靈芝菌絲的生長并改善靈芝的品質(zhì)。

本研究僅就稀土元素對桑黃菌絲生長以及桑黃活性物質(zhì)合成的影響進行了初步探討，而對稀土元素的作用機制還有待于進一步的深入研究。

[1]戴玉成.藥用擔子菌一鮑氏層孔菌 （桑黃）的新認識[J].中草藥，2003， 34(1)： 94－95.

[2]Li G,Kim DH,Kim TD,et al.Protein－bound polysaccharide from Phellinus linteus induces G2/M phase arrest and apoptosis in SW480 human colon cancer cells[J].Cancer letters,2004(216):175－181.

[3]Shone MY,Kim TH,Sung NJ.Antioxidants and free radical scavenging activityof Phellinus baumii(Phellinus of Hymenochaetaceae)extracts[J].Food Chemistry,2003(82):593－597.

[4]張萬國，胡晉紅，蔡溱.桑黃對實驗性肝纖維化大鼠血液動力學的影響[J].解放軍藥學學報， 2002， 18(6)： 341－343.

[5]鄭立軍，沈業(yè)壽，季俊虬，等.桑黃胞外多糖藥理活性的初步研究[J].食品科學， 2007， 28(1)： 318－321.

[6]呂英華，王建芳，李玉平，等.藥用真菌桑黃的研究進展[J].蠶業(yè)科學， 2009， 35(1)： 204－210.

[7]牛廣財，朱丹，李志江，等.響應面法優(yōu)化桑黃菌產(chǎn)胞外多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)的研究[J].生物數(shù)學學報，2009，24(3)：523－530.

[8]Wu JY,Wang CG,Mei XG.Stimulation of taxol production and excretion in Taxus spp.cell cultures by rare earth chemical lanthanum[J].Journal of Biotechnology,2001(85):67－73.

[9]Ouyang J,Wang XD,Zhao B,et al.Effects of rare earth elements on the growth of Cistanche deserticola cells and the production of phenylethanoid glycosides[J].Journal of Biotechnology,2003(102):129－134.

[10]陳立紅,閆偉.稀土對蒙古口蘑 （Tricholom ongolicum）及四種菌根真菌菌絲體生長的影響[J].內(nèi)蒙古大學學報：自然科學版，2002， 33(3)： 295－297.

[11]何冬蘭，溫川蓉.鑭和鈰對靈芝菌絲生長的影響[J].中草藥，1997(11)： 684－686.

[12]李增利.稀土元素鐠、釹、鉺對紅菇多糖深層發(fā)酵的影響[J].食品科學， 2007， 28(12)： 312－316.

[13]楊德俊，馮紀南，李強國，等.稀土離子對杏鮑菇菌絲生長促進作用及增產(chǎn)效果的試驗[J].食用菌，2007(5)：9－10.

[14]歐陽小麗，張曉昱，王宏勛，等.桑黃菌絲體多糖提取方法的研究[J].中國食用菌， 2004， 24(5)： 35－37.

[15]張志軍，朱越.桑黃中三萜化合物提取工藝[J].食品研究與開發(fā)，2009， 30(9)： 81－83.

[16]劉艷芳，楊焱，賈薇，等.藥用真菌桑黃總黃酮測定方法研究[J].食用菌學報， 2006， 13(2)： 45－48.

[18]張金桐，崔德芳，丁起盛.稀土元素對藥用靈芝品質(zhì)影響的研究[J].中國中藥雜志， 1995， 20(9)： 531－532.

[19]郭麗瓊，郭麗青.稀土對靈芝生長影響的初步研究[J].中國藥學雜志， 1999， 34(3)： 155－157.

[20]沈霞，余勝光.加La液體培養(yǎng)靈芝富集有機Se的影響因素研究[J].西南農(nóng)業(yè)學報， 2008， 21(6)： 1654－1657.

[21]D’Aquino L,Morgana M,Carboni MA,et al.Effect of some rare earth elements on the growth and lanthanide accumulation in different Trichoderma strains[J].Soil Biology&Biochemistry,2009(41):2406－2413.