雷祖培，余宏傲，張書潤(rùn)，林瑞豐，康華靖

（1.浙江烏巖嶺國家級(jí)自然保護(hù)區(qū) 管理局，浙江 泰順 325500；2.溫州科技職業(yè)學(xué)院 園林系，浙江 溫州 325006）

浙江雪膽Hemsleya zhejiangensis為葫蘆科Cucurbitaceae雪膽屬Hemsleya多年生攀援草本，僅分布于浙江溫州泰順烏巖嶺海拔800 m以下的山谷灌叢中和竹林下，為浙江特有種[1]。浙江雪膽塊莖具有清熱解毒、消腫止痛之功效，廣泛用于治療腸炎、菌痢、冠心病、氣管炎、慢性子宮頸炎、帶狀皰疹、腫瘤等多種疾病[2-4]。因其療效好，副作用低，因而在醫(yī)學(xué)上日益受到青睞，應(yīng)用前景十分廣闊。目前，對(duì)浙江雪膽的研究較少，哀建國等[5]對(duì)浙江雪膽群落學(xué)特征進(jìn)行了調(diào)查研究；雷祖培等[6]對(duì)浙江雪膽體內(nèi)幾種金屬元素分布及其與土壤養(yǎng)分之間的關(guān)系進(jìn)行了研究；葉曉霞等[4]探討了超聲提取——分光光度法測(cè)定浙江雪膽中總皂苷含量；葉曉霞等[7]從藥用角度測(cè)定浙江雪膽塊莖中的微量元素，證明浙江雪膽中含有豐富的人體必需微量元素，且微量元素的含量明顯高于中華雪膽，這為浙江雪膽的進(jìn)一步的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。由于浙江雪膽種群稀少，使用莖蔓扦插繁殖母本數(shù)量極少，扦插繁殖速度慢，同時(shí)容易受季節(jié)限制，嚴(yán)重阻礙了以這一新藥源植物的生產(chǎn)利用。本研究主要通過研究浙江雪膽的初代培養(yǎng)基和最佳植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)配比對(duì)其增殖的影響，以進(jìn)一步為塊莖的快速誘導(dǎo)和增殖打下良好的基礎(chǔ)，最終實(shí)施人工栽培，以解決其資源匱乏和物種的有效保護(hù)。

1 材料與方法

1.1 材料

浙江雪膽塊莖于2008年12月采自浙江烏巖嶺國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)竹林下的雪膽群落，栽植于裝有腐殖質(zhì)土的花盆中，待長(zhǎng)出幼苗后，采集具芽的幼嫩莖段作為外植體。試驗(yàn)于2009年2月至2010年5月在溫州科技職業(yè)學(xué)院農(nóng)生系生物工程研究所植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中完成。

1.2 試驗(yàn)方法

剪取莖段，用洗滌劑涮洗后自來水沖洗1 h，再用蒸餾水沖洗3次，然后在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行操作。用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇浸泡30 s，100.0 g·kg-1次氯酸鈉浸泡8 min進(jìn)行殺菌。消毒后的幼嫩莖段用無菌水浸洗5次，剪去基部，留1 cm左右的莖段，插栽在固體MS（Murashige and Skoog）基本培養(yǎng)基（蔗糖30.0 g·kg-1，瓊脂6.0 g·kg-1，pH 5.8）中，插入深度2～3mm。 在 （25±2）℃組培室中培養(yǎng)。7 d后除去污染瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，21 d時(shí)轉(zhuǎn)接，然后進(jìn)行以下植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和培養(yǎng)基對(duì)浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)影響的研究。

1.2.1 6-芐基氨基腺嘌呤（6-BA）對(duì)浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，附加α萘乙酸（NAA）0.02 mg·L-1，酸堿度整為pH 5.8～6.0；蔗糖為30.0 g·L-1，瓊脂作凝固劑。設(shè)置質(zhì)量濃度分別為0， 0.10， 0.20， 0.50， 1.00， 2.00， 5.00 和 10.00 mg·L-1。

1.2.2 NAA對(duì)浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA 1.00 mg·L-1，設(shè)置質(zhì)量濃度分別為 0， 0.01， 0.05， 0.10， 0.50和 1.00 mg·L-1。

1.2.3 不同質(zhì)量濃度NAA和6-BA配比對(duì)繁殖系數(shù)的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA和NAA，均設(shè)置5個(gè)質(zhì)量濃度（2.00，1.00，0.50，0.10和0 mg·L-1）組合進(jìn)行不同配比試驗(yàn)。1.2.4 不同基本培養(yǎng)基對(duì)繁殖系數(shù)的影響 分別以MS，B5，N6和WPM（woody plant medium）等4種培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)。

在光照強(qiáng)度為2000 lx左右，光照時(shí)間為10 h·d-1的培養(yǎng)室中進(jìn)行恒溫（25±2）℃培養(yǎng)35后，記錄不同處理下浙江雪膽生長(zhǎng)情況和繁殖系數(shù)。繁殖系數(shù)是指在一次繼代培養(yǎng)中，由一個(gè)繁殖單位（嫩莖、芽、或芽叢等）產(chǎn)生的新苗 （芽）個(gè)數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)均設(shè)5個(gè)重復(fù)，求其平均數(shù)。

表1 6-BA對(duì)浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響Table1 Effect on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis of 6-BA

2 結(jié)果與討論

2.1 6-BA對(duì)浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響

不同6-BA質(zhì)量濃度對(duì)浙江雪膽組培苗的繁殖系數(shù)影響較大，不同質(zhì)量濃度之間差異都達(dá)到顯著水平 （表1）。 在質(zhì)量濃度 0.1～10.00 mg·L-1范圍內(nèi)，浙江雪膽組培苗的繁殖系數(shù)隨6-BA質(zhì)量濃度的升高而呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在0.50 mg·L-1時(shí)其繁殖系數(shù)最大，達(dá)到10.80；其次為1.00 mg·L-1，其值達(dá)到 6.80；再次為 0.20 mg·L-1和 2.00 mg·L-1； 其余質(zhì)量濃度下浙江雪膽組培苗的繁殖系數(shù)較低。

2.2 NAA對(duì)浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響

浙江雪膽組培苗的繁殖系數(shù)在NAA質(zhì)量濃度為0 mg·L-1時(shí)，組培苗的繁殖系數(shù)為1.0；在低質(zhì)量濃度（小于0.20 mg·L-1）下，其繁殖系數(shù)隨著NAA質(zhì)量濃度的升高而增大，在0.20 mg·L-1時(shí)其值最大，達(dá)到5.6（表2）；當(dāng)NAA質(zhì)量濃度增加至0.50 mg·L-1時(shí)，浙江雪膽組培苗的繁殖系數(shù)開始受到抑制。

2.3 不同質(zhì)量濃度的NAA和6-BA配比對(duì)浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響

不同質(zhì)量濃度的NAA和6-BA配比對(duì)浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響結(jié)果見表3。試驗(yàn)表明：最適宜于浙江雪膽組培快繁的芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1和MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1。2種配方下的浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)無顯著差異。

表2 NAA對(duì)浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響Table2 Effect on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis of NAA

表3 6-BA和NAA不同質(zhì)量濃度配比對(duì)浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響Table3 Effect on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis of 6-BA and NAA

2.4 不同基本培養(yǎng)基對(duì)浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響

以WPM，B5，N6和MS為基本培養(yǎng)基對(duì)浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響見表4。不同培養(yǎng)基下浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)均較高，其中以MS培養(yǎng)基的效果最佳，其繁殖系數(shù)達(dá)到16.80，與其他3種培養(yǎng)基相比，其差異達(dá)到了顯著水平。

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響Table4 Effect of basic medium on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis

3 討論和結(jié)論

試驗(yàn)表明：在沒有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)處理下，浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)均為1.00；不同6-BA和NAA質(zhì)量濃度對(duì)其組培苗繁殖系數(shù)有較大影響，最佳質(zhì)量濃度分別為0.50 mg·L-1和0.20 mg·L-1，其繁殖系數(shù)分別為10.80和5.60；6-BA對(duì)浙江雪膽叢生芽分化的促進(jìn)作用顯著高于NAA。不同質(zhì)量濃度的NAA和6-BA配比的最佳配方為MS+6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1和 MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1， 2 種配比下組培苗繁殖系數(shù)分別為19.30和18.10，與單一植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)最佳質(zhì)量濃度下相比，其差異也均達(dá)到了顯著水平。

通過試驗(yàn)觀察，25～35 d為1個(gè)繼代周期是較為適宜的，因?yàn)檫@個(gè)時(shí)期誘導(dǎo)的效果可以充分表現(xiàn)出來，而培養(yǎng)基的成分還沒有完全變化到影響組織的生長(zhǎng)，并且可為轉(zhuǎn)接提供較大量的材料。浙江雪膽對(duì)組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分的要求并不嚴(yán)格，基本培養(yǎng)基MS，B5，N6和WPM均可作為組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，都可滿足浙江雪膽生長(zhǎng)的需要，就快速繁殖而言，MS和B5培養(yǎng)基是比較適宜的培養(yǎng)基。

植物組織培養(yǎng)再生小植株一般有3條途徑：一是外植體先形成愈合組織，愈合組織分化出不定芽，由不定芽再發(fā)育成小植株；二是由外植體表面直接誘導(dǎo)產(chǎn)生小鱗莖或小芽，再由小鱗莖或不定芽發(fā)育成小植株；三是由組織表層和內(nèi)層一些特化了的胚性細(xì)胞經(jīng)多次分裂發(fā)育成胚狀體而形成小鱗莖，小鱗莖再形成小植株。本實(shí)驗(yàn)采用第1種途徑，該方法較易進(jìn)行，但繁殖周期較長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)除了以上3種增殖方式外，浙江雪膽的組培苗在初代培養(yǎng)（2009年2月）中不經(jīng)生根階段就可形成微型塊莖（2009年9月）（圖1），且該微型塊莖可直接發(fā)育成新個(gè)體。此法如能和莖尖培養(yǎng)結(jié)合起來，將為浙江雪膽脫毒種塊莖的繁育建立很好的體系。但是第2年（2010年）繼代培養(yǎng)則未發(fā)現(xiàn)微型塊莖的形成，推測(cè)與取樣時(shí)間和部位相關(guān)，具體原因尚需進(jìn)一步研究。

圖1 分別為浙江雪膽的花、塊根、初代培養(yǎng)幼苗和愈合組織Figure1 Hemsleya zhejiangensis： flower， tuber， initial culture seedling and callus

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