苗玉和，劉 巖，閆艷麗，郭 宇，舒秀偉

(遼寧益康生物股份有限公司，遼寧遼陽 111000)

仔豬腹瀉是影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的主要疾病之一，以往大多采用抗生素治療，由此導(dǎo)致的耐藥性菌株的出現(xiàn)、動物腸道微生態(tài)平衡的破壞、畜禽產(chǎn)品藥物殘留等嚴(yán)重問題，已經(jīng)威脅到人類和動物的健康。研制無毒副作用、無殘留、無污染的微生態(tài)制劑，已成為必然的發(fā)展趨勢。目前，應(yīng)用于微生態(tài)制劑的菌種主要有乳酸桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、某些芽孢桿菌、酵母菌等。乳酸桿菌是仔豬腸道正常微生物區(qū)系中的優(yōu)勢菌群，可利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，有的還產(chǎn)生乙酸及其他揮發(fā)性脂肪酸，對致病菌具有很好的抑制作用，對維持仔豬腸道微生物區(qū)系平衡和消化機(jī)能起著重要作用［1－7］。目前，已有眾多學(xué)者報道利用乳酸桿菌制成的微生態(tài)制劑，替代抗生素預(yù)防和治療畜禽消化道疾?。?－9］。本研究擬從健康仔豬腸道中分離篩選出抗逆性乳酸桿菌，用來研制高效、專一的乳酸桿菌豬用微生態(tài)制劑。

1 材料與方法

1.1 材料 在遼陽市某豬場，選定12～60日齡健康仔豬，截取腸道，冷藏并迅速送實驗室進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.2 菌株 豬源致病性大腸桿菌 C83902株(CVCC196)、仔豬副傷寒沙門氏菌 C500株(CVCC79500)、金黃色葡萄球菌(CVCC1882)均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基［1］。

1.4 主要試劑 各種糖發(fā)酵管購自杭州天和微生物試劑有限公司;基因組提取試劑盒、Ex－taq、dNTP等PCR試劑等購自寶生物(大連)有限公司;其余均為分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 乳酸桿菌的分離鑒定 參照文獻(xiàn)［1，3］方法進(jìn)行。

1.2.2 抑菌試驗 采用牛津杯法［8］，測定5株乳酸桿菌對豬源致病性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌能力。

1.2.3 生長曲線的測定 將分離菌株活化后以2%(V/V)的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，每隔2 h取樣至30 h，測定 OD600值，繪制生長曲線。

1.2.4 耐酸試驗 將抑菌試驗篩選出的菌株活化后，按 2%接種量接種于 pH 值為 1.5、2.5、3.5、4.5的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8 h;用無菌移液管取出1 mL菌液進(jìn)行梯度稀釋，取3個適宜稀釋度菌液各0.1 mL，涂布MRS固體培養(yǎng)基，進(jìn)行平板菌落計數(shù)，并計算菌株存活率［11］。

1.2.5 耐膽鹽試驗 將抑菌試驗篩選出的菌株活化后，按2%的接種量接種于膽鹽濃度為(W/V)0.1%、0.2%、0.3%、0.4% 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng)16 h，平板計數(shù)法進(jìn)行菌落計數(shù)，并計算菌株的存活率［12］。

1.2.6 耐胰酶試驗 將抑菌試驗篩選出的菌株活化后，按2%的接種量分別接種于含有胰蛋白酶的液體培養(yǎng)基中，胰蛋白酶的濃度分別為(W/V)0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，37 ℃培養(yǎng)16 h，平板計數(shù)法進(jìn)行菌落計數(shù)，并計算菌株的存活率［11］。

1.2.7 PCR鑒定 對上述試驗篩選出的抗逆性較強(qiáng)的約氏乳桿菌進(jìn)行PCR鑒定。根據(jù)Genbank上登錄的約氏乳桿菌16S rDNA序列設(shè)計一對特異性引物:P1(上游):5’－TGGGCGTCTATAATGCAG －3’;P2(下游):5’－CTCTGTCTACTTAGACGG －3’，引物由寶生物(大連)有限公司合成。以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)為:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性50 s、54℃退火1 min、72℃延伸1 min，30個循環(huán)后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定 本試驗共分離到5株革蘭氏陽性無芽孢桿菌，編號分別為 LY1、LY7、LY11、LY16、LY25。根據(jù)革蘭氏染色及生化鑒定結(jié)果，對照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定方法》，初步鑒定為 LY1為羅伊氏乳桿菌;LY7、LY16為約氏乳桿菌;LY11為嗜酸乳桿菌;LY25為植物乳桿菌。

2.2 抑菌試驗結(jié)果 結(jié)果見表1。5株乳酸桿菌對3株豬源致病菌均有一定的抑制能力。其中，LY7、LY11、LY25菌株對大腸桿菌、沙門氏菌的抑菌能力較強(qiáng)，且LY7最強(qiáng);LY11、LY25對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好，LY7對金黃色葡萄球菌的抑菌能力雖不及LY11、LY25，但也明顯強(qiáng)于LY1、LY16。LY1、LY164菌株對3種致病菌的抑菌能力均相對較差。綜合試驗結(jié)果，選擇 LY7、LY11、LY25菌株進(jìn)行后續(xù)試驗。

表1 乳酸菌抑菌圈直徑測定結(jié)果 mm

2.3 生長曲線測定 圖1結(jié)果表明，LY7、LY11、LY25菌株在液體MRS培養(yǎng)基中，起初0～4 h處于延滯期，而LY25菌株延滯期較長，為0～6 h;LY7、LY11在4～8 h進(jìn)入對數(shù)生長期，而LY25在6～12 h進(jìn)入對數(shù)生長期;LY7在14 h的OD600達(dá)到最高并開始進(jìn)入穩(wěn)定期，而LY11在12 h OD600達(dá)到最高并開始進(jìn)入穩(wěn)定期，LY25在16 h OD600達(dá)到最高并開始進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖1 3株乳酸桿菌生長曲線

2.4 耐酸試驗 由圖2可知，LY7、LY11在pH2.5條件下，培養(yǎng)8 h 后仍有較高存活率，pH3.5、pH4.5對菌株生長無抑制;而LY25對低pH耐受力較差。

圖2 不同pH值條件下乳酸桿菌的存活率

2.5 耐膽鹽試驗 結(jié)果見表2。LY7對高濃度膽鹽有很強(qiáng)的耐受能力，在0.3%膽鹽濃度下，培養(yǎng)16 h，存活率仍能達(dá)到55%;而LY11、LY25對膽鹽耐受能力很差，特別是LY25，基本對膽鹽無耐受能力。

2.6 耐胰酶試驗 由圖3可知，LY7對胰酶有一定的耐受能力，在1.2%胰酶濃度下作用16 h，存活率可達(dá)65%，而LY11、LY25對胰酶耐受能力較差。

表2 不同膽鹽濃度下的乳酸桿菌存活率

圖3 不同胰酶濃度下的乳酸桿菌存活率

2.7 PCR鑒定結(jié)果 電泳檢測顯示(圖4)，擴(kuò)增到約1 500 bp的目的條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后測序，擴(kuò)增到的目的片段大小為1 467 bp，對照NCBI上發(fā)表的約氏乳桿菌16S rDNA序列，進(jìn)行同源性分析，與AB295648、FJ557011等菌株同源性為99.1%，進(jìn)一步從分子水平證實該菌株為約氏乳桿菌。

圖4 PCR鑒定結(jié)果

3 討論

3.1 目前，市售的微生態(tài)制劑菌種絕大部分來自土壤、水等環(huán)境，與動物體內(nèi)環(huán)境存在著較大差異，真正應(yīng)用于動物時，使用效果將大打折扣。本試驗分離得到的5株乳酸桿菌均來自健康仔豬腸道，理論上講，能夠很好的適應(yīng)仔豬腸道環(huán)境。

3.2 我們首先經(jīng)抑菌試驗，初步篩選出3株(LY7、LY11、LY25)抑菌能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行下一步試驗。而乳酸菌制劑經(jīng)口服方式飼喂動物，須能夠耐受胃內(nèi)低pH的環(huán)境。本實驗選育的LY7、LY11菌株在 pH2.5，8 h 后存活率仍有 78.33%、81.44%，pH3.5、4.5對菌株生長無抑制。而 LY25菌株在pH2.5，8 h后存活率僅為6.73%。仔豬出生時胃內(nèi)pH值在5～6之間，因高產(chǎn)酸細(xì)菌定植而逐漸下降，數(shù)小時后pH值即降至4左右，2月齡前pH值保持在3左右，成年豬的最低pH值可達(dá)到1.5［12］。因此，LY7、LY11菌株相對LY25菌株更有可能通過豬的胃進(jìn)人腸道。

3.3 作為口服制劑，還需具備耐受小腸中膽鹽等形成的高滲透壓環(huán)境的能力。0.1%和0.2%膽鹽對LY7菌株生長沒有影響，在膽鹽濃度升至0.3%以后，LY7菌株在16 h時存活率仍能達(dá)到55%，而LY11、LY25菌株對膽鹽的耐受性較差。對哺乳仔豬而言，其膽囊內(nèi)膽汁量很少，在出生后3周內(nèi)膽汁量增加緩慢，一般在0.03% ～0.3%范圍內(nèi)波動［13－14］。所以LY7菌株在腸道的存活機(jī)會很大。

3.4 本實驗同時對 LY7、Y11、LY25菌株的耐胰酶能力進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，LY7菌株可耐受1.0%的胰酶，而 LY11、LY25菌株對胰酶的耐受性較差。

3.5 綜合上述試驗結(jié)果，約氏乳桿菌LY7株可以作為研制豬用微生態(tài)制劑的候選菌株，我們將開展進(jìn)一步的試驗研究。

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