霍 鵬， 黃麗涵， 朱平川， 徐遠(yuǎn)金*

（1.廣西大學(xué)廣西亞熱帶生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530004；2.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧 530004）

膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法同時(shí)測(cè)定感冒軟膠囊中4種活性成分

霍 鵬1，2， 黃麗涵1， 朱平川1， 徐遠(yuǎn)金1，2*

（1.廣西大學(xué)廣西亞熱帶生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530004；2.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧 530004）

目的 建立中藥復(fù)方制劑感冒軟膠囊（羌活、麻黃、桂枝、葛根、黃芩、川芎、防風(fēng)等）中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素及黃芩苷4種活性成分同時(shí)測(cè)定的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法。方法 以甲醇提取樣品，電泳緩沖液為10 mmol/L磷酸氫二鈉-20 mmol/L硼酸（pH 8.0），內(nèi)含20 mmol/L十二烷基硫酸鈉（SDS）及體積分?jǐn)?shù)分別為27%（v/v）異丙醇和18%（v/v）乙腈作有機(jī)改性劑，采用75 μm（i.d）×60（ef 50）cm的未涂層彈性石英毛細(xì)管柱，0.5 psi（進(jìn)樣時(shí)間6 s）壓力進(jìn)樣，分離電壓30 kV，紫外檢測(cè)波長214 nm，溫度25℃。結(jié)果 4種活性成分在23 min內(nèi)獲得基線分離，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素和黃芩苷的線性范圍分別為 1.5 ～200 μg/mL（r=0.999 4）、2.4 ～150 μg/mL（r=0.999 8）、1.8 ～120 μg/mL（r=0.999 1），4.5 ～300 μg/mL（r=0.999 1），檢出限分別為 0.50、0.80、0.60、1.5 μg/mL（S/N=3）。樣品加標(biāo)回收率在91.0% ～109%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.2%。結(jié)論 本法簡便、快速，具良好的精密度和回收率，已成功用于實(shí)際樣品的分析。

膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜；感冒軟膠囊；鹽酸麻黃堿；鹽酸偽麻黃堿；葛根素；黃芩苷

感冒軟膠囊為常用中成藥，由羌活、麻黃、桂枝、葛根、黃芩、川芎、防風(fēng)等十四味中藥材經(jīng)提取等工藝制成，具有散風(fēng)解熱之功效，用于外感風(fēng)寒引起的頭痛身熱、鼻塞流涕、惡寒無汗、骨節(jié)酸痛、咽喉腫痛等癥，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第六冊(cè)［1］。其中麻黃中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿，葛根中葛根素及黃芩中黃芩苷為感冒軟膠囊中的活性成分。文獻(xiàn)報(bào)道了HPLC測(cè)定感冒軟膠囊中葛根素［2-3］、黃芩苷［4-5］和用薄層色譜法測(cè)定該藥中鹽酸麻黃堿［6］，采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定鹽酸麻黃堿 和 鹽 酸 偽 麻 黃堿［7］、葛根 素［8-9］或 黃 芩苷［10-12］亦有報(bào)道，韓杰等［13］也采用 HPLC 法測(cè)定了感冒軟膠囊中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素、黃芩苷4種活性成分，但因生物堿類和黃酮類的色譜行為差別較大而未能實(shí)現(xiàn)在同一流動(dòng)相下進(jìn)行4種成分的同時(shí)分離檢測(cè)。為此，本實(shí)驗(yàn)建立了膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法同時(shí)測(cè)定感冒軟膠囊中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素、黃芩苷4種活性成分的分析方法。方法準(zhǔn)確，操作方便，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

P/ACETMMDQ毛細(xì)管電泳儀帶二極管陣列檢測(cè)器（美國Beckman公司）；未涂層彈性石英毛細(xì)管（75 μm×60 cm，有效長度50 cm）（河北永年銳灃色譜器件有限公司）；Orion 720A型酸度計(jì)/離子計(jì)（美國Thermo公司）；Synthesis A10TM超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；ME 215S電子天平（德國Sartorius公司）。

鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素和黃芩苷對(duì)照品購自中國藥品生物制品檢定所；感冒軟膠囊（洛陽君山制藥有限公司，批號(hào)：091202、100201）；甲醇、異丙醇和乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 電泳條件 以20 mmol/L SDS-10 mmol/L磷酸氫二鈉-20 mmol/L硼酸（pH=8.0），內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)分別為27%（v/v）異丙醇和18%（v/v）乙腈為電泳緩沖液，未涂層彈性石英毛細(xì)管（75 μm×60 cm）為分離通道，壓力進(jìn)樣（0.5 psi×6 s），分離電壓30 kV，分離溫度25℃，檢測(cè)波長214 nm。所有溶液在使用前均用0.45 μm濾膜過濾，并超聲脫氣。毛細(xì)管每天使用前，分別用0.1 mol/LNaOH、超純水和緩沖液各沖洗10 min。

2.2 對(duì)照品溶液的配制 取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素和黃芩苷對(duì)照品各約10 mg，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成1.00 mg/mL的對(duì)照品貯備液，密封于4℃下冰箱中保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用80%甲醇稀釋至所需濃度。

2.3 樣品溶液的配制 取數(shù)粒膠囊樣品的內(nèi)容物，混勻，取約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇超聲提取60 min后，取出，放冷，以4 000 r/min，－4℃離心15 min，吸出上清液至25 mL量瓶中，殘?jiān)眉状枷礈旌笾匦绿崛∫淮?，合并上層清液，用甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.4 線性關(guān)系與檢出限 取各對(duì)照品貯備液，分別配制成不同質(zhì)量濃度的系列混合溶液，于優(yōu)化后的條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)3次，以峰面積平均值（Y）對(duì)對(duì)照品混合液中4種活性成分的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，以信噪比等于3為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得4種活性成分的檢出限。結(jié)果見表1。

表1 4種成分的線性關(guān)系及檢出限Tab.1 Regression equation and detection limit of four compounds

2.5 精密度試驗(yàn) 取同一感冒軟膠囊樣品溶液，按2.3項(xiàng)下方法制備，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定5次，記錄鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素和黃芩苷的峰面積，得RSD 分別為 1.7%、2.3%、0.43%、0.17%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別于 0、2、4、6、8 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果RSD均小于1.4%，表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab.2 Stability test

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批樣品5份，按2.3項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素和黃芩苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.14 mg/g、0.559 mg/g、0.467 mg/g、0.651 mg/g，RSD 分別為 1.9%、1.5%、1.3%、2.0%，表明分析方法的重復(fù)性良好。

2.8 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素和黃芩苷的同批樣品共9份，3份為一組，按低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度分別加入對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算4種活性成分的平均回收率和RSD，結(jié)果見表3。

2.9 樣品測(cè)定 分別精密吸取不同批號(hào)樣品各5份，按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，代入回歸方程計(jì)算得到樣品中4種活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4。對(duì)照品及樣品的電泳譜圖見圖1。

表3 樣品加標(biāo)回收率（n=3）Tab.3 Recoveries of four compounds in samples（n=3）

表4 樣品測(cè)定結(jié)果（n=5）Tab.4 Results of sample analysis（n=5）

圖1 對(duì)照品（A）及樣品（B）的電泳譜圖Fig.1 The electropherograms of standard（A）and sample（B）

3 討論

3.1 電泳分離條件的優(yōu)化

3.1.1 緩沖溶液中磷酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)分離的影響實(shí)驗(yàn)考察了Na2HPO4質(zhì)量濃度在5～25 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)分離的影響，質(zhì)量濃度較小時(shí)，譜峰變寬，遷移時(shí)間短，當(dāng)Na2HPO4質(zhì)量濃度低于5 mmol/L時(shí)，鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿分離度很小，未達(dá)基線分離。當(dāng)質(zhì)量濃度較大時(shí)，減弱了溶質(zhì)間的相互作用，降低了樣品擴(kuò)散，使譜峰變窄，分離度增大，遷移時(shí)間增加，當(dāng) Na2HPO4質(zhì)量濃度高于25 mmol/L時(shí)，各峰的遷移時(shí)間較長，基線噪音增加。當(dāng)Na2HPO4質(zhì)量濃度為10 mmol/L時(shí)，各物質(zhì)間分離度最好，遷移時(shí)間也相對(duì)較短。

3.1.2 SDS質(zhì)量濃度對(duì)分離的影響 在緩沖溶液中加入SDS，可使譜峰變窄，改善分離度，在膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜模式下比在毛細(xì)管區(qū)帶電泳模式下分離效果更好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SDS質(zhì)量濃度太低時(shí)，各成分間無法分離。隨著SDS質(zhì)量濃度增加，分析物和膠束體結(jié)合的機(jī)會(huì)增多，從而延長了遷移時(shí)間，同時(shí)也增加了分離度。綜合考慮分離度和遷移時(shí)間，選擇SDS的質(zhì)量濃度為20 mmol/L。

3.1.3 緩沖溶液中硼酸質(zhì)量濃度對(duì)分離的影響 實(shí)驗(yàn)考察了硼酸質(zhì)量濃度在5～25 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)各峰分離度的影響，硼酸質(zhì)量濃度過低或過高時(shí)都會(huì)降低鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿兩峰之間的分離度，且4種成分的峰形也會(huì)隨之變差。經(jīng)反復(fù)考察，選擇硼酸質(zhì)量濃度為20 mmol/L。

3.1.4 緩沖溶液pH值對(duì)分離的影響 實(shí)驗(yàn)考察了pH從6到10范圍內(nèi)變化對(duì)各峰的影響，當(dāng)pH小于6時(shí)，鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿不能實(shí)現(xiàn)完全分離，pH大于10后，各成分峰形變差，且遷移時(shí)間隨pH值的升高而延長。實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)pH=8.0時(shí)最佳，4種活性成分都已達(dá)到基線分離。

3.1.5 有機(jī)改性劑的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分離的影響 有機(jī)改性劑可通過改變緩沖體系中水相的特性，影響SDS膠束的結(jié)構(gòu)，增加分析物的溶解度而提高分離度。待測(cè)成分為疏水性質(zhì)，加入有機(jī)改性劑，可防止其沉淀析出，使測(cè)定順利進(jìn)行。我們考察了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙腈和異丙醇（均為0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%）對(duì)4種活性成分遷移時(shí)間和分離度的影響。發(fā)現(xiàn)，當(dāng)緩沖液中只含一種有機(jī)改性劑時(shí)，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿完全重疊。隨著乙腈和異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，遷移時(shí)間逐漸延長，分離度逐漸增大，當(dāng)緩沖溶液中乙腈質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%、異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%時(shí)，4種活性成分可獲得較好的分離度，靈敏度高。

3.2 分離電壓對(duì)分離的影響 考察了15～30 kV范圍內(nèi)分離電壓對(duì)結(jié)果的影響。隨著分離電壓的升高，電滲流速度加快，樣品的遷移時(shí)間明顯縮短，峰形尖銳。當(dāng)分離電壓達(dá)到30 kV時(shí)，4種活性成分能得到快速而有效的分離，未存在重現(xiàn)性差的問題。因此，選擇分離電壓為30 kV。

3.3 進(jìn)樣時(shí)間對(duì)分離的影響 固定0.5 psi的壓力進(jìn)樣，在6～12 s范圍內(nèi)改變進(jìn)樣時(shí)間。發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣時(shí)間越長，靈敏度越高。但隨著進(jìn)樣量的增大，分離度下降，峰形變差。綜合考慮，選擇進(jìn)樣時(shí)間為6 s。

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Simultaneous determination of four effective components in Ganmao Soft Capsule by micellar electrokinetic capillary chromatography

HUO Peng1，2， HUANG Li-han1， ZHU Ping-chuan1， XU Yuan-jin1，2*
（1.Guangxi Key Laboratory of Subtropical Bioresource Conservation and Utilization，Guangxi University，Nanning 530004，China；2.College of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China）

AIMTo establish a new method for simultaneously determing the contents of ephedrine hydrochloride，pseudoephedrine hydrochloride，puerarin and baicalin in Ganmao Soft Capsule（Notopterygii Rhizoma et Radix，Ephedrae Herba，Cinnamomi Ramulus，Puerariae Lobatae Radix，Scutellariae Radix，Chuanxiong Rhizoma，Saposhnikoviae Radix，etc.）by micellar electrokinetic capillary chromatography（MECC）.METHODSThe samples in preparation were extracted by methanol，20 mmol/L SDS-10 mmol/L Na2HPO4-20 mmol/L H3BO3mixture（containing 27%2-Propanol and 18%acetonitrile，pH=8.0）was selected for the running buffer.The four effective components were separated by an uncoated fused silica capillary（75 μm ×60 cm）with the detection wavelength of 214 nm，voltage of 30 kV and temperature of 25℃.RESULTSThe baseline separation of four components was achieved within 23 min.The linear ranges were 1.5-200 μg/mL，2.4-150 μg/mL，1.8-120 μg/mL，4.5-300 μg/mL for ephedrine hydrochloride，pseudoephedrine hydrochloride，puerarin and baicalin with detection limits of 0.50，0.80，0.60，1.5 μg/mL，respectively.The average recoveries of the four components were between 91.0% －109%with all relative standard deviations less than 3.2%.CONCLUSIONThe method is simple，rapid with excellent precision and high recovery and can be used for the quality control of Ganmao Soft Capsules.

micellar electrokinetic capillary chromatography（MECC）；Ganmao Soft Capsule；ephedrine hydrochloride；pseudoephedrine hydrochloride；puerarin；baicalin

R927.2

A

1001-1528（2011）07-1190-04

2010-12-14

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（桂科自0832034）

霍 鵬（1984—），女，碩士生，從事色譜、質(zhì)譜及其聯(lián)用方法的研究。E-mail：haip0716@163.com

* 通信作者：徐遠(yuǎn)金，博士，教授。Tel：（0771）3237743，E-mail：yjxu@gxu.edu.cn