張伏軍， 尹小玲， 李 卿， 秦 劍

（1.重慶三峽中心醫(yī)院藥劑科，重慶404000；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065）

高效液相色譜法測定穿龍骨刺片中薯蕷皂苷和淫羊藿苷

張伏軍1， 尹小玲1， 李 卿2， 秦 劍2

（1.重慶三峽中心醫(yī)院藥劑科，重慶404000；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065）

目的 測定穿龍骨刺片（穿山龍，淫羊藿，狗脊，川牛膝，熟地黃，枸杞子）中薯蕷皂苷、淫羊藿苷。方法 采用高效液相色譜法，色譜柱為C18柱，以乙腈-水為流動相，檢測波長為203 nm（薯蕷皂苷）、270 nm（淫羊藿苷）。結(jié)果 薯蕷皂苷進樣量、淫羊藿苷進樣量分別在0.56～5.60 μg、0.24～2.40 μg范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r分別為0.999 9、0.999 8）；平均回收率分別為 98.23%、98.34%，RSD 分別為 0.88%（n=6）、0.62%（n=6）。結(jié)論 HPLC 法快速、準確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

薯蕷皂苷；淫羊藿苷；穿龍骨刺片；HPLC

穿龍骨刺片收載于《衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》第十四冊，處方由穿山龍、淫羊藿、狗脊、川牛膝、熟地黃、枸杞子組成，具補腎，健骨，活血，止痛功效。臨床用于骨質(zhì)增生，骨刺疼痛等癥。文獻報道該制劑質(zhì)量控制和定量測定方法多采用高效液相色譜法測定淫羊藿中淫羊藿苷［1-3］；穿山龍作為方中君藥，有祛風除濕，舒筋通絡，活血止痛作用［4］，含多種甾體皂苷，薯蕷皂苷的質(zhì)量分數(shù)約1.5% ～2.6%，是穿山龍藥材中主要成分。目前國內(nèi)生產(chǎn)穿龍骨刺片的企業(yè)較多，為有效監(jiān)測制劑質(zhì)量，進一步提高品種的質(zhì)量標準，建立方中君臣藥主要成分的定量方法，對該制劑的質(zhì)量控制和產(chǎn)品規(guī)范十分必要。本實驗采用高效液相色譜法測定穿龍骨刺片中薯蕷皂苷、淫羊藿苷，快速，準確，重現(xiàn)性好，專屬性強，可用于該制劑的質(zhì)量控制和評價指標。

1 儀器與試藥

Waters 2695型高效液相色譜儀、2996二極管陣列檢測器；AE-240S型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；KQ-50B型超聲波清洗器（120W，40KHZ；昆山市超聲儀器有限公司）；薯蕷皂苷對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：111701-200501）；淫羊藿苷對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110737-200312）水為去離子水，乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；穿龍骨刺片（市售產(chǎn)品，批號：100901，100910，101001）。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2 薯蕷皂苷測定

2.1 色譜條件 色譜柱Symmetry C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-水（26 ∶74）為流動相；體積流量1.0 mL/min；檢測波長為203 nm；柱溫30℃。理論板數(shù)按薯蕷皂苷峰計算應不低于3 000。

2.2 供試品溶液的制備 取本品10片，精密稱定，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇40 mL，超聲處理（功率120 W，頻率40 KHZ）30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，過D101大孔樹脂柱（3g，Φ0.9 cm），用水60 mL 洗脫，棄去水洗液，再用80%乙醇35 mL洗脫，收集乙醇洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備 取薯蕷皂苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.28 mg的溶液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備 按處方量并以相同工藝制備陰性對照（缺穿山龍）樣品，照上述供試品溶液制備方法處理，得陰性對照溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，進樣，記錄色譜圖，測定結(jié)果，陰性對照色譜中，在與薯蕷皂苷對照品及供試品色譜相應保留時間處無相應色譜峰，表明其他組分對測定薯蕷皂苷成分無干擾，分離度大于1.5，見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液2、4、8、16、20 μL，進樣，以薯蕷皂苷峰面積積分值為縱坐標，進樣量（μg）為橫坐標，進行回歸分析，薯蕷皂苷進樣量在0.56～5.60 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好，得回歸方程：Y=261 285X－106 127（r=0.999 9）。

2.7 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，重復進樣6次，測定薯蕷皂苷，其峰面積積分值相對標準偏差（RSD）為0.75%（n=6）。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、14 h 進樣，測定，薯蕷皂苷峰面積積分值的相對標準偏差（RSD）為0.92%。表明供試品溶液在14 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復性試驗 取同一批樣品6份，精密稱定，照供試品溶液制備方法，測定，計算薯蕷皂苷量，結(jié)果樣品中含薯蕷皂苷平均為0.21 mg/片，相對標準偏差（RSD）為1.01%（n=6）。表明效果良好。

2.10 加樣回收率試驗 取已測定的同批樣品6份（含薯蕷皂苷為 0.21 mg/片），各約 0.25 g，精密稱定，分別精密加入薯蕷皂苷對照品甲醇溶液（0.14 mg/mL）8、10、12 mL，照供試品溶液制備方法處理，進樣，記錄色譜圖，計算回收率，結(jié)果平均回收率為98.23%，RSD 為0.88%，表明回收率良好，見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果 （n=6）Tab.1 Results of revovery test（n=6）

2.11 樣品測定 取不同批次穿龍骨刺片樣品各3份，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，分別精密吸取對照品溶液 5 μL、20 μL 及供試品溶液 10 μL，測定，用外標兩點法方程計算薯蕷皂苷量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果 （n=3）Tab.2 Results of contents determination （n=3）

3 淫羊藿苷測定

3.1 色譜條件 色譜柱 Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-水（30 ∶70）為流動相；體積流量0.8 mL/min；檢測波長為270 nm；柱溫30℃。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應不低于3 000。

3.2 供試品溶液的制備 取本品10片，精密稱定，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇45 mL，超聲處理（功率120 W，頻率40 KHZ）30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取4次，每次30 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

3.3 對照品溶液的制備 取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.12 mg的溶液，即得。

3.4 陰性對照溶液的制備 按處方量并以相同工藝制備陰性對照（缺淫羊藿）樣品，照上述供試品溶液制備方法處理，得陰性對照溶液。

3.5 系統(tǒng)適用性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，進樣，記錄色譜圖。測定結(jié)果：陰性對照色譜中，在與淫羊藿苷對照品及供試品色譜相應保留時間處無相應色譜峰，表明方中其他組分對測定淫羊藿苷成分無干擾，且分離度大于 2.0，見圖 2。

3.6 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液2、4、8、16、20 μL，進樣，以淫羊藿苷峰面積積分值為縱坐標，進樣量（μg）為橫坐標，進行回歸分析，淫羊藿苷進樣量在0.24～2.40 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好，得回歸方程：Y=1 925 482X－98 456.5（r=0.999 8）。

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

3.7 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，重復 進樣6次，測定淫羊藿苷，其峰面積積分值相對標準偏差（RSD）為0.80%（n=6）。

3.8 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于0、1、4、8、10、14 h 進樣，淫羊藿苷峰面積積分值相對標準偏差（RSD）為0.73%。結(jié)果供試品溶液在14 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.9 重復性試驗 取同一批樣品6份，精密稱定，照供試品溶液制備方法，測定，計算淫羊藿苷，結(jié)果樣品中含淫羊藿苷平均為1.16 mg/片，相對標準偏差（RSD）為0.97%（n=6）。表明方法重復性良好。

3.10 加樣回收率試驗 取已測定的同批樣品6份（含淫羊藿苷為 1.16 mg/片），各約 0.25 g，精密稱定，分別精密加入淫羊藿苷對照品甲醇溶液（0.029 mg/mL）16、20、24 mL，照供試品溶液制備方法處理，進樣，記錄色譜圖，計算回收率，結(jié)果平均回收率為98.34%，RSD為0.62%，表明回收率良好，見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果 （n=6）Tab.3 Results of revovery test（n=6）

3.11 樣品測定 取不同批次穿龍骨刺片樣品各3份，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，分別精密吸取對照品溶液 5 μL、20 μL 及供試品溶液 10 μL，測定，用外標兩點法方程計算淫羊藿苷量，結(jié)果見表2。

4 討論

采用高效液相色譜法測定穿龍骨刺片中薯蕷皂苷，尚未見文獻報道。測定該品種中薯蕷皂苷和淫羊藿苷，方法簡便、準確，重現(xiàn)性良好，為該制劑的質(zhì)量控制和檢測方法提供了理論依據(jù)。

由于產(chǎn)品制備工藝采用部分生藥細粉入藥，其余藥材為水提取物制備而成，供試品溶液的提取如果采用溶劑直接超聲處理［5-7］，將會對色譜柱的柱效產(chǎn)生大的損傷，參考文獻［8-10］，對測定淫羊藿苷的樣品溶液進行純化比較試驗，聚酰胺柱層析法、乙酸乙酯提取法、大孔樹脂吸附法，試驗結(jié)果以乙酸乙酯提取法操作簡單，快速，供試品溶液純化效果明顯；并對乙酸乙酯提取次數(shù)進行了研究，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取4次后，殘留樣品未能檢測有淫羊藿苷目標峰，故選擇乙酸乙酯提取4次為宜；且對淫羊藿苷定量測定進行了方法學考察，結(jié)果表明本方法可以用于制劑中淫羊藿苷的定量測定。

高效液相色譜法測定制劑中薯蕷皂苷，對供試品提取、純化方法進行比較。由于供試品中穿山龍藥材部分為原生藥粉末，故采用甲醇提取；另對采用超聲提取法與回流提取法作比較，結(jié)果顯示超聲處理與回流提取差別不大，為了提取完全并省時節(jié)能，故選用甲醇超聲提取法；結(jié)合文獻報道方法［11-13］，對供試品采用D101型樹脂、AB-8型樹脂、D201型樹脂進行純化對比試驗，結(jié)果表明，應用D101型樹脂純化效果明顯，吸附率和解吸率優(yōu)于其它類型樹脂，能夠純化供試品溶液，通過定量測定方法學考察，結(jié)果比較滿意。

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Determination of dioscin and icariin in Chuanlong Guci Tablet by HPLC

ZHANG Fu-jun1， YIN Xiao-ling1， LI Qing2， QIN Jian2

（1.Chongqing Three Gorges Central Hospital，Chongqing 404000，China；2.Chonging Academy of Chinese Materia Medica，Chongqing 400065，China）

AIMTo determine the contents of dioscin and icariin in Chuanlong Guci Tablet（Dioscoreae nipponicae Rhizoma，Epimedii Folium，Cibotii Rhizoma，Cyathulae Radix，Rehmanniae Radix Praeparata，Lycii Fructus）.METHODSHPLC method was adopted and a C18column was used.The mobile phase was acetonitrile-water.The detection wavelengths were set at 203 nm（dioscin）、and 270 nm（icariin）.RESULTSThe linear ranges were 0.56-5.60 μg（r=0.999 9）for dioscin，0.24-2.40 μg（r=0.999 8）for icariin，respectively.Their average recoveries were 98.23%（RSD was 0.88%），98.34%（RSD was 0.62%）.CONCLUSIONThe method is quick and accurate，and it can be used for quality control of Chuanlong Guci Tablet.

dioscin；icariin；Chuanlong Guci Tablet；HPLC

R927.2

A

1001-1528（2011）07-1182-04

2011-03-06

張伏軍（1978—），男，主管藥師，從事臨床藥學藥事管理。Tel：15978923366