劉雅敏， 郭丹丹， 楊 晉， 張正偉， 劉延澤

（1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州450008；2.北方民族大學(xué)化工學(xué)院，寧夏 銀川750021；3.洛陽市中心醫(yī)院，河南洛陽 471000）

指紋圖譜法優(yōu)選訶子提取工藝的研究

劉雅敏1， 郭丹丹1， 楊 晉2， 張正偉3， 劉延澤1

（1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州450008；2.北方民族大學(xué)化工學(xué)院，寧夏 銀川750021；3.洛陽市中心醫(yī)院，河南洛陽 471000）

目的 優(yōu)選訶子有效部位的提取工藝參數(shù)。方法 運用正交L8（27）實驗，以各提取實驗條件的HPLC指紋圖譜色譜峰面積的變化量和相似度為指標，考察提取工藝條件。結(jié)果 優(yōu)化的訶子提取工藝參數(shù)為藥材粒度60目、70%乙醇、8倍溶劑量、浸漬提取3次，每次30 min。結(jié)論 指紋圖譜技術(shù)可以作為工藝篩選過程中的有效評價手段。

訶子；提取工藝；指紋圖譜

訶子為使君子科欖仁屬植物訶子Terminalia chebulaRetz.及其變種絨毛訶子Terminalia chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實，具有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽、調(diào)和藥性、解毒等功效［1］?，F(xiàn)代研究顯示，訶子具有抗氧化、抗菌、抗病毒、強心、抗誘變、抗癌、抗阿米巴原蟲、抗動脈粥樣硬化以及強心作用等藥理作用［2-3］，這些作用主要集中于可水解丹寧類成分［4］。目前在訶子提取工藝研究中，多采用總丹寧成分量作為工藝優(yōu)選指標。但這類成分化學(xué)穩(wěn)定性差，總丹寧量變化不能全面反映出工藝因素對藥材中丹寧類成分的提取率以及穩(wěn)定性的影響，因而無法得出真正的最佳提取工藝條件，也使制劑質(zhì)量難以進行標準化控制。目前指紋圖譜被認為是能夠較全面地反映藥材提取物質(zhì)量變化的質(zhì)控技術(shù)。故本實驗以選定指紋圖譜色譜峰面積的變化量和相似度為指標，以訶子中的主要有效成分和特征性成分訶子酸（chebulinic acid）［5］為參照物，采用多指標綜合評分法優(yōu)選提取工藝參數(shù)，為保證訶子提取物的質(zhì)量，制備出訶子標準提取物奠定了基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 儀器 LC-2010A高效液相色譜儀（日本島津）；DiamonsilTMC18柱（4.6 mm ×250 mm，5μ m）；工作站：CBM-102（日本島津）；檢測器：SPD-20A（日本島津）；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（版本2004A）（中國藥典委員會推薦）。

1.2 試劑 訶子酸對照品由劉延澤教授提供，經(jīng)光譜鑒定、HPLC檢測純度在95%以上；甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。柱層析用吸附劑Toyopearl HW-40（C）為日本Tosoh公司產(chǎn)品。

1.3 藥材 訶子，產(chǎn)地云南，由陳隨清教授鑒定為使君子科植物訶子Terninalia chebulaRetz.。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為DiamonsilTMC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相采用線性梯度洗脫，A相為甲醇，B相為0.5%的冰醋酸水溶液，體積流量1.0 mL/min，SPD-20A 檢測器，柱溫30 ℃，波長254 nm，分析時間60 min。線性梯度洗脫程序見表1。

表1 線性梯度洗脫程序

2.2 提取因素水平的確定 用浸漬法進行提取。實驗因素水平見表2。

2.3 正交實驗方案設(shè)計 采用正交實驗表L8（27）設(shè)計實驗方案。

2.4 提取液的制備［5］稱取訶子粗粉8份，每份10 g，精密稱定，分別按照2.3項條件提取，過濾，合并提取液，定容至500 mL，備用。精密量取各正交實驗條件下提取液10 mL，揮干溶劑，以70%丙酮定容于100 mL量瓶中，于60℃減壓濃縮至5 mL，上ToyopearlHW-40（C）柱（1 cm，柱長20 cm，吸附劑高10 cm）進行柱層析，依次用蒸餾水50 mL、5%甲醇50 mL洗脫除去雜質(zhì)，然后用甲醇-丙酮-水（6∶2∶2）300 mL洗脫（至洗脫液三氯化鐵-鐵氰化鉀薄層顯色反應(yīng)為陰性），所得洗脫液于60℃減壓濃縮至干，用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液進樣10 μL進行HPLC分析，選定的色譜峰面積結(jié)果見表3。

表2 因素水平

另稱取訶子粗粉10 g，用70%丙酮提取3次，每次150 mL，過濾，合并提取液，定容至500 mL。余操作同上，取續(xù)濾液進樣10 μL進行HPLC分析，以選定色譜峰面積作為單寧類成分近似完全浸出的基準。

表3 指標峰峰面積值

2.5 對照品溶液的制備與測定 精密稱取訶子酸對照品1.19 mg，置1 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，制成對照品溶液。精密吸取對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定，作為對照。

2.6 訶子提取工藝與HPLC圖譜的相關(guān)性 通過指紋圖譜分析軟件，把訶子各提取工藝條件下的色譜圖重疊比較；然后求得各提取工藝與70%丙酮提取結(jié)果的相似度K。結(jié)果見表4、表7、表8。

2.7 結(jié)果分析 選定正交表各個實驗指紋圖譜當中13個共有色譜峰的峰面積作為提取工藝的評價指標，采用多指標綜合評分法進行數(shù)據(jù)標準化綜合處理［6］。以Xij表示正交實驗的第i次實驗的色譜圖中第j個色譜峰峰面積值，以各指標的最大值（Xj）max（即各色譜圖中同一相對保留時間的各色譜峰中峰面積值最大者）作為參照，對同一指標各數(shù)據(jù)進行標準化處理，Dij表示第j個指標下的第i個測定值的標準化數(shù)據(jù)。

再按各指標的重要程度和各組數(shù)據(jù)的相對標準差確定加權(quán)系數(shù)。以SDj表示第j個指標下Dij的標準差，以RSDj表示第j個指標的相對標準差，然后再根據(jù)各指標相對標準差賦權(quán)RSD/RSDj，其中RSD為指定指標（參照物訶子酸）的相對標準差；根據(jù)各指標的重要程度賦權(quán)為Ej，由于要全面考慮到訶子中的各個組分，故認為指紋圖譜中的各個色譜峰（群）所代表的各組分（群）都很重要，均設(shè)為1即Ej=1。結(jié)合各指標的重要程度和各組數(shù)據(jù)的相對標準差確定的權(quán)重系數(shù)為：

因此，多指標實驗公式為：

設(shè)P9為1，則其余各實驗丹寧提取率為

［4］式計算所得為兼顧各指標綜合效應(yīng)結(jié)果，得分越大越好。對所得數(shù)據(jù)進行直觀分析和方差分析。結(jié)果見表4～8。

以提取率為指標時，訶子的粒度、乙醇濃度、提取時間、乙醇濃度與提取次數(shù)的相互作用對訶子指紋圖譜所指定的13個色譜峰峰面積變化有顯著影響。各因素對測定結(jié)果的影響次序為B＞D＞A＞E＞C。由于B、E的交互作用顯著，根據(jù)表4得B2E2為最優(yōu)搭配。以相似度為指標時，溶劑量對各實驗條件下所提成分與丙酮提取物的相似性有顯著影響。綜合上述分析結(jié)果，確定優(yōu)化的提取工藝條件為A2B2C1D2E2，即訶子粉碎粒度60目、乙醇濃度70%、8倍溶劑量、攪拌提取3次、每次30 min。

表4 正交實驗方案與結(jié)果

表5 提取率交互作用

表6 提取率方差分析

表7 相似度交互作用

表8 相似度方差分析

2.8 驗證實驗 按照優(yōu)選出的最佳工藝條件，用同一批藥材重復(fù)提取3次，實驗結(jié)果按照2.7項下方法進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果見表9。

表9 驗證試驗

表明此提取工藝合理可行、穩(wěn)定。

3 討論

3.1 訶子中的有效成分丹寧為多羥基化合物，該類成分在光照和高溫條件下不穩(wěn)定，極易發(fā)生結(jié)構(gòu)降解。成分穩(wěn)定性差的特點限制了它的制劑開發(fā)。在對訶子中的丹寧成分進行提取時，應(yīng)控制好提取的溫度和時間，力求快速、完全，以達到不破壞丹寧類成分之目的。所以我們選用多重冷浸并攪拌提取的方法，通過正交實驗考察粒度、乙醇濃度、溶劑量、攪拌時間、提取次數(shù)等因素，最終確定最優(yōu)提取條件為：將訶子粉碎成60目粗粉，8倍量70%乙醇提取3次，每次30 min。

3.2 對于丹寧類成分，目前公認70%丙酮是提取率高、使結(jié)構(gòu)保持較好穩(wěn)定性的提取溶劑，故本實驗將其提取物的指紋圖譜總峰面積作為比較丹寧類成分提取率的基準，以及提取條件對丹寧成分結(jié)構(gòu)變化（相似度）的比較基準。但是由于丙酮的毒性和價格原因，不宜作為訶子總丹寧工業(yè)化提取的溶劑［5，7-8］，因此本實驗采用乙醇為提取溶劑，結(jié)果表明提取效果與丙酮相接近。

3.3 對于成分復(fù)雜的中藥制劑，在其制劑工藝研究中，僅僅考察單一指標性成分或總成分的提取率，往往不能夠全面反映制劑工藝因素對總體有效成分的含量與穩(wěn)定性的影響，因而也就不能真正找到合理的制劑工藝條件，無法做到制劑質(zhì)量的穩(wěn)定可控。指紋圖譜技術(shù)是目前認為比較能反映中藥制劑綜合成分狀態(tài)的質(zhì)量控制方法，其用于中藥制劑工藝還處于探索階段。本研究用訶子提取工藝的HPLC指紋圖譜特征色譜峰的面積變化量，以及與70%丙酮提取物的色譜峰相似度作為評價指標，基本能夠體現(xiàn)工藝條件對訶子中有效成分的提取效果的全面影響，準確說明該工藝的優(yōu)劣，最大限度地保留訶子中的有效成分，從而更加全面的體現(xiàn)訶子自身的藥理活性，保證成品的質(zhì)量。

［1］趙國平，戴 慎，陳仁濤.中藥大辭典：上［M］.2版.上海：上?？萍汲霭嫔纾?006.1641.

［2］劉玉梅，宋寶安.訶子化學(xué)成分與生物活性的研究進展［J］.貴州大學(xué)學(xué)報，2007，2（2）：208-212.

［3］張慶容，田 紅.訶子的藥理活性研究進展［J］.國外醫(yī)藥，植物藥分冊，2004，19（6）：237-240.

［4］石 碧，狄 瑩.丹寧的藥理活性［J］.中草藥，1998，29（7）：487-490.

［5］丁 崗，劉延澤.不同來源訶子中3種可水解丹寧的定量分析［J］.中藥材，2000，23（6）：329-331.

［6］韓可勤，楊靜化，劉曉東.藥學(xué)應(yīng)用概率統(tǒng)計［M］.南京：東南大學(xué)出版社，2000：1301.

［7］匡海學(xué).中藥化學(xué)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：378-379.

［8］黃朝生，彭 軒.某市54家企業(yè)有機溶劑職業(yè)危害情況調(diào)查［J］.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2005，5（5）：1093-1094.

R944.2+7

A

1001-1528（2011）07-1168-04

2010-08-31

河南省科技攻關(guān)項目（524410076）

劉雅敏（1960—），教授，研究方向：中藥固體制劑技術(shù)。Tel：（0371）65575822，E-mail：lymll2001@yahoo.com.cn