方文娟， 余璐堯， 李大鵬， 黃金活， 呂俊華*

（1.無限極（中國）有限公司，廣東廣州510665；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室廣東廣州510632；3.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州 510130）

馬紅丸含藥血清對(duì)人肝癌smmc-7721細(xì)胞bcl-2和bax mRNA表達(dá)的影響

方文娟1， 余璐堯2， 李大鵬3， 黃金活3， 呂俊華2*

（1.無限極（中國）有限公司，廣東廣州510665；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室廣東廣州510632；3.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州 510130）

目的 探討馬紅丸（馬錢子、紅娘子、全蝎等）含藥血清對(duì)人肝癌smmc-7721細(xì)胞bcl-2和bax mRNA表達(dá)的影響。方法 采用血清藥理學(xué)方法制備馬紅丸（MHP）和阿霉素（ADM）含藥血清以及對(duì)照血清，作用于smmc-7721細(xì)胞。MTT法檢測(cè)含藥血清對(duì)smmc-7721細(xì)胞增殖的影響；測(cè)定含藥血清對(duì)smmc-7721細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；RT-PCR檢測(cè)含藥血清對(duì)smmc-7721細(xì)胞bcl-2mRNA和bax mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果 30%體積的馬紅丸和阿霉素含藥血清作用于smmc-7721細(xì)胞72 h，明顯抑制細(xì)胞的增殖（P＜0.01），培養(yǎng)液中LDH的釋放量和細(xì)胞凋亡率明顯高于空白血清組（P＜0.01），bcl-2 mRNA表達(dá)下降，bax mRNA表達(dá)升高（P＜0.01）。結(jié)論 30%馬紅丸含藥血清作用于人肝癌smmc-7721細(xì)胞72 h，可明顯抑制細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞中bcl-2 mRNA表達(dá)，促進(jìn)bax mRNA表達(dá)有關(guān)。

book=7,ebook=327

馬紅丸；血清藥理學(xué)；人肝癌smmc-7721細(xì)胞；凋亡

原發(fā)性肝癌（Primary Liver Cancer，PLC）的發(fā)病率和死亡率一直位居惡性腫瘤的前位，對(duì)人類健康危害極大，也是國內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)界研究的重點(diǎn)之一［1］。馬紅丸是以馬錢子（Semen strychni）、紅娘子（Huechys sanguinea）、全蝎（Scorpio）、川足（Scolopendra subspinipes）、守宮（Gekko japonicus Dumeril et Bibron）、生甘草（Glycyrrhizae Radix）、糯米粉等組成的用于治療腫瘤的純中藥復(fù)方制劑，臨床上對(duì)原發(fā)性肝癌、胃癌等多種腫瘤具有良好的療效［2-3］。為了探討馬紅丸抑制腫瘤的可能作用機(jī)制，利用含藥血清的制備方法［4］制備馬紅丸含藥血清，培養(yǎng)人肝癌smmc-7721細(xì)胞，探討馬紅丸含藥血清對(duì)人肝癌smmc-7721細(xì)胞的抑瘤作用以及對(duì)bcl-2和bax mRNA表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為200 g左右。由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)為：SCXK（粵）2008-0002。

1.2 細(xì)胞 人肝癌smmc-7721細(xì)胞，購于中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞庫。

1.3 主要儀器與藥品

1.3.1 主要儀器 熒光顯微鏡（日本Olympus公司），Tecan Safire2型全波長多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司），NANODROP 1000 spectrophotometer（美國Thermo公司），F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司），Minicycle（美國 Bio-Rad，MJ Rearch公司），DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（英國SynGene公司）。

1.3.2 藥品 馬紅丸：丸劑，廣州市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑；阿霉素（注射用鹽酸多柔比星）：粉針劑，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)081004A。

1.4 試劑 四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國Sigma公司），乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)測(cè)定試劑盒（20090316）（南京建成生物工程研究所），Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（090713）（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），瓊脂糖粉（法國Biowest公司），M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司），Trizol細(xì)胞裂解液（1382739），bax、bcl-2及 GAPDH引物（美國invitrogen公司），2×Taq PCR Green Mix（西安舟鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司），Nucleic Acid Stain，100bp DNA Ladder II，DTT，DEPC 水（北京普博欣生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) smmc-7721細(xì)胞用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37°C、5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 含藥血清的制備［4］健康清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、馬紅丸組及阿霉素組，馬紅丸組給藥劑量為22.75 g/kg，阿霉素組給藥劑量為1.27 mg/kg，空白對(duì)照組給予等體積生理鹽水。每天2次，每次間隔12 h，連續(xù)3 d，給藥前4 h禁食不禁水。末次灌胃1 h后，3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈采血，室溫下靜置4 h，3 000 r/min離心15 min分離血清，經(jīng)56 °C、30 min 滅活處理后，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝于2 mL EP管中，置-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 MTT法 以2×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，細(xì)胞繼續(xù)生長24～36 h后，用體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%的空白血清，馬紅丸和阿霉素含藥血清作用于細(xì)胞，以正常條件培養(yǎng)的細(xì)胞做為對(duì)照，每組4個(gè)復(fù)孔。含藥血清分別作用細(xì)胞24、48、72 h后，吸去舊培養(yǎng)基，換以新鮮無血清培養(yǎng)基90 μL，并加入5 g/L 的 MTT 10 μL，繼續(xù)孵育4 h。4 h后棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，待藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解，于570 nm波長處用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值。

2.4 LDH測(cè)定 用30%空白血清，馬紅丸和阿霉素含藥血清作用于細(xì)胞后，去培養(yǎng)液上清，按試劑盒說明書操作。

2.5 細(xì)胞流式法測(cè)定細(xì)胞凋亡 以4×104/mL的密度接種于6孔板中，每孔2 mL，細(xì)胞繼續(xù)生長24～36 h后，用30%空白血清、馬紅丸和阿霉素含藥血清作用于細(xì)胞，以正常條件培養(yǎng)的細(xì)胞做為對(duì)照。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞一次，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞。將消化下來的細(xì)胞加入收集的細(xì)胞培養(yǎng)液中，混勻，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μL binding buffer，重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，再加入5 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

2.6 RT-PCR法 以4×104/mL的密度接種于6孔板中，每孔2 mL，讓細(xì)胞生長24～36 h后，用30%空白血清，馬紅丸和阿霉素含藥血清作用于細(xì)胞，以正常條件培養(yǎng)的細(xì)胞做為對(duì)照。（1）Trizol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA；（2）測(cè)定RNA濃度：從提取的RNA中取出2 μL，于NANODROP 1000型微量分光光度計(jì)上測(cè)定280 nm及260 nm處的吸光度；（3）逆轉(zhuǎn)錄：按promega公司提供的試劑盒說明書加入各組分，采用10 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，于PCR儀上70 °C，孵育5 min后，再42 °C孵育1 h，放 -20 °C保存?zhèn)溆茫唬?）PCR過程：按順序加入各組分，采用25 μL反應(yīng)體系，于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)如下：bcl-2 94 °C 5 min；94 °C 45 s，64 °C 45 s，72 °C 2 min，循環(huán)35次；72 °C 7 min；bax及GAPDH：94°C 7 min；94 °C 1 min，60 °C 45 s，72 °C 45 s，循環(huán) 35 次；72 °C 10 min。bcl-2 引物：上游5＇-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3＇，下游 5＇-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物 318bp；bax引物：上游-5＇-TCCACCAAGAAGCTG AGCGAG-3 ＇，下 游 5 ＇-GTCCAGCCCATGATGGCCT-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物 257bp；GAPDH引物：上游 5＇-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3＇，下游5＇-TCCAGGGGTCTACTCCTG-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物 512bp；（5）擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，用Bio-Rad Quantity One軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行掃描和光密度分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 馬紅丸含藥血清對(duì)人肝癌smmc-7721細(xì)胞增殖的影響

30 %馬紅丸含藥血清及阿霉素含藥血清作用于smmc-7721細(xì)胞24 h和72h時(shí)，與空白血清組比較，明顯抑制細(xì)胞增殖的作用 （P＜0.01），以72h抑瘤作用更為明顯，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以72 h作為抑瘤時(shí)間。見表1。

表1 馬紅丸含藥血清對(duì)人肝癌smmc-7721細(xì)胞增殖的抑制作用（±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effect of Mahong Pill containing serum on the proliferation of human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=6）

表1 馬紅丸含藥血清對(duì)人肝癌smmc-7721細(xì)胞增殖的抑制作用（±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effect of Mahong Pill containing serum on the proliferation of human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=6）

與空白血清組比較，##P＜0.01；與24 h抑制率比較＊＊P＜0.01。##P＜0.01 vs blank serum group；＊＊P＜0.01 vs 24 h group.

組別24 h OD 抑制率/%48 h OD 抑制率/%72 h OD 抑制率/%空白血清組0.77±0.05 - 1.48±0.04 - 1.92±0.03 -馬紅丸組 0.68±0.02 11.69±2.99 1.18±0.02## 20.27±3.38＊＊ 1.43±0.02## 25.52±1.76＊＊阿霉素組 0.62±0.03 19.48±4.76 1.02±0.06## 31.08±4.65＊＊ 1.19±0.05## 32.28±2.82＊＊

3.2 馬紅丸含藥血清對(duì)人肝癌smmc-7721細(xì)胞LDH釋放量的影響

30 %空白對(duì)照組與正常組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而30%馬紅丸含藥血清及阿霉素含藥血清組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的LDH量明顯升高，與30%空白血清組比較具有顯著差異（P＜0.01）。見圖1。

3.3 馬紅丸含藥血清對(duì)smmc-7721細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)可見正常對(duì)照組細(xì)胞及空白對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率分別為4.7%和5.5%，兩組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。30%馬紅丸含藥血清和阿霉素含藥血清組的凋亡率分別為23.6%和26.8%，與空白血清組比較具有明顯差異（P＜0.01）。見圖2。

3.4 馬紅丸含藥血清對(duì)人肝癌smmc-7721細(xì)胞bcl-2和bax mRNA表達(dá)的影響

30 %空白血清組細(xì)胞與正常對(duì)照組bcl-2/GAP-DH，bax/GAPDH和bax/bcl-2比值無明顯差異（P＞0.05）；30%馬紅丸含藥血清及阿霉素含藥血清處理smmc-7721細(xì)胞后，bcl-2 mRNA表達(dá)降低，bax mRNA表達(dá)增加，bax/bcl-2比值具有明顯差異 （P＜0.01）。見圖3和表2。

圖1 馬紅丸含藥血清對(duì)人肝癌smmc-7721細(xì)胞LDH釋放量的影響（±s，n=3）與空白對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01。Fig.1 Influence of Mahong Pill containing serum on the lactate dehydrogenase（LDH）leakage of human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=3）＊＊P＜0.01 vs blank serum group.

圖2 馬紅丸含藥血清對(duì)人肝癌smmc-7721細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=3）與空白對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01。Fig.2 Influence of Mahong Pill containing serum on the apoptotic rate of human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=3）＊＊P＜0.01 vs blank serum group.

4 討論

腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞增殖分化異常及其凋亡受抑制有關(guān)，腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞存活與凋亡的平衡失調(diào)，存活大于凋亡，則腫瘤細(xì)胞數(shù)目增加［5］。因此，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤防治的重要手段。凋亡是細(xì)胞在基因調(diào)控下的主動(dòng)死亡形式，調(diào)控凋亡的基因可分為凋亡促進(jìn)基因和凋亡抑制基因兩類。Bcl-2是有抑制凋亡作用的基因，Bax的作用與Bcl-2相反。下調(diào)Bcl-2或上調(diào)Bax可促進(jìn)多種因素誘導(dǎo)的多種腫瘤細(xì)胞凋亡［6-7］。本實(shí)驗(yàn)采用血清藥理學(xué)的方法，觀察了馬紅丸含藥血清對(duì)人肝癌smmc-7721細(xì)胞增殖的抑制作用和促細(xì)胞凋亡以及對(duì)bcl-2和bax的影響。結(jié)果表明，馬紅丸含藥血清具有良好的抑制人肝癌smmc-7721細(xì)胞增殖作用，促進(jìn)細(xì)胞LDH外漏，并在一定濃度范圍內(nèi)，呈劑量依賴性促進(jìn)smmc-7721細(xì)胞凋亡。同時(shí)可見，馬紅丸含藥血清處理后，可誘導(dǎo)smmc-7721細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因Bax表達(dá)，減少凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)，Bax與Bcl-2比值升高，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

圖3 馬紅丸含藥血清對(duì)bcl-2和bax mRNA表達(dá)的影響M.marker 1.正常對(duì)照 2.空白對(duì)照 3.馬紅丸 4.阿霉素Fig.3 Influence of Mahong Pill containing serum on the expression of bcl-2 and bax mRNA in human hepatoma smmc-7721cellsM.marker 1.normal control 2.blank serum control 3.Mahong Pill 4.adriamycin

表2 馬紅丸含藥血清對(duì)人肝癌smmc-7721細(xì)胞bcl-2/GAPDH和bax/GAPDH的影響（±s，n=3）Tab.2 Influence of Mahong Pill containing serum on the expression of bcl-2/GAPDH and bax/GADPH in human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=3）

表2 馬紅丸含藥血清對(duì)人肝癌smmc-7721細(xì)胞bcl-2/GAPDH和bax/GAPDH的影響（±s，n=3）Tab.2 Influence of Mahong Pill containing serum on the expression of bcl-2/GAPDH and bax/GADPH in human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=3）

與空白對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01。＊＊P＜0.01 vs blank serum group.

組別 bcl-2/GAPDH bax/GAPDH bax/bcl-2比值正常對(duì)照組0.87±0.02 0.59±0.04 0.67±0.03空白對(duì)照組 0.85±0.04 0.60±0.01 0.65±0.05馬紅丸組 0.56±0.03＊＊ 0.99±0.03＊＊ 1.88±0.07＊＊阿霉素組 0.47±0.01＊＊ 1.22±0.10＊＊ 2.58±0.06＊＊

綜上所述，馬紅丸含藥血清對(duì)人肝癌smmc-7721細(xì)胞增殖具有抑制和促凋亡作用，其作用機(jī)理與減少凋亡抑制基因Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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Effect of Mahong Pill containing serum on the expression of bax and bcl-2 mRNA of human hepatoma smmc-7721 cells

FANG Wen-juan1， YU Lu-yao2， LI Da-peng3， HUANG Jin-huo3， Lü Jun-hua2
（1.Infinitus（China）Co.，Ltd，Guangzhou 510665，China；2.School of Pharmacy，Jinan University，Guangzhou 510632，China；3.Guangzhou Traditional Chinese Medical Hospital，Guangzhou 510130，China）

Mahong Pill；serologic pharmacology；human hepatoma smmc-7721 cells；apoptosis

R285.5

A

1001-1528（2011）07-1141-05

2010-06-02

方文娟（1980—），女，碩士，工程師，從事腫瘤藥理學(xué)研究。Tel：（020）81107220，E-mail：wenjuan-fang@infinitus.com.cn

*通信作者：呂俊華（1954—），男，教授。Tel：（020）85223764，E-mail：yaolilv@163.com