劉永剛， 羅景慧

（1.武警廣東總隊醫(yī)院藥劑科，廣東廣州510507；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院藥學部，廣東廣州 510515）

白藜蘆醇對過氧化氫誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用

劉永剛1， 羅景慧2*

（1.武警廣東總隊醫(yī)院藥劑科，廣東廣州510507；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院藥學部，廣東廣州 510515）

目的 研究白藜蘆醇（Res）對過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVECs）損傷及凋亡的保護作用及機制。方法 體外培養(yǎng)第4～6代HUVECs，分為空白對照組、H2O2損傷組（300 μmoL/L）、Res低濃度（5 μmoL/L）、中濃度（10 μmoL/L）、高濃度（20 μmoL/L）預(yù)處理1 h加H2O2損傷組。用噻唑藍比色法檢測HUVECs活力，試劑盒檢測丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）量、超氧化物歧化酶（SOD）和還原型谷胱甘肽（GSH）活性，流式細胞儀分析細胞凋亡率，western blot檢測caspase-3的表達。結(jié)果 與空白對照組比較，H2O2損傷模型組細胞活力顯著降低、MDA和LDH量顯著增加、SOD和GSH活性顯著下降、細胞凋亡率和caspase-3表達顯著增加（P＜0.01）。結(jié)論 Res通過降低與凋亡過程直接相關(guān)的caspase-3表達，抑制H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡，減輕H2O2對內(nèi)皮細胞的損傷作用，從而產(chǎn)生保護血管內(nèi)皮細胞的作用。

白藜蘆醇；氧化性損傷；內(nèi)皮細胞

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是中藥虎杖的主要活性成分之一，具有廣泛而重要的生物學活性。研究表明，Res是一種天然抗氧化劑，具有降低血液黏稠度保持血液暢通、預(yù)防癌癥的發(fā)生及發(fā)展、抗過敏、抗突變、抗炎癥、調(diào)節(jié)免疫等藥理活性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、化妝品和食品添加劑等領(lǐng)域［1-3］。研究表明，Res對缺血-再灌注腦損傷、心肌缺血損傷具有保護作用，且保護作用均與抗病灶局部氧化性反應(yīng)、炎性反應(yīng)等相關(guān)［4-6］，提示Res對心腦血管的保護作用存在著共同作用機制，但是，Res防治腦損傷的機制尚未闡明。本研究擬通過體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVECs），以過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)HUVECs損傷模型，研究Res對氧化性損傷的內(nèi)皮細胞保護作用及其與凋亡的關(guān)系，探討Res防治心、腦血管損傷性疾病的作用機理，為開發(fā)Res及其類似物治療心腦血管損傷性疾病提供實驗資料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 Res購自西安奧賽斯生物技術(shù)工程有限公司，用DMSO配制成原液，分裝凍存，臨用前用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，使DMSO在培養(yǎng)液中的體積分數(shù)不大于0.000 5，實驗表明該濃度對細胞的生長沒有影響。人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVECs）購自中國科學院上海生物化學研究所。馬血清、DMEM/F12（DF12）培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于Gibco公司（USA），胎牛血清購于杭州四季青生物技術(shù)有限公司，碘化丙啶（propidium iodide，PI）、Annexin V-異硫氰熒光素（FITC）、DNA酶、RNA酶、均購于Sigma公司（USA），多聚賴氨酸（poly-l-lysine，PLL）、3，（4，5-二甲基噻唑）-2，5-二苯基溴化四氮唑（MTT）購自武漢博士德生物技術(shù)工程公司，丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒購于南京建成生物工制品研究所，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng) HUVECs，以 DMEM/F12培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)。每500 mL DMEM/F12培養(yǎng)基含人表皮細胞生長因子（hEGF）2.0 mL、胎牛血清（FBS）10 mL、GA-1000（50 g/L硫酸慶大霉素和50 mg/L兩性霉素-B）0.5 mL、人成纖維細胞生長因子（hFGF-B）2.0 ml、抗壞血酸 0.5 mL、血管內(nèi)皮細胞生長因子 （VEGF）0.5 mL以及R3-IGF-1（長鏈R-胰島素樣生長因子）0.5 mL，培養(yǎng)第4～6代細胞用于實驗。

1.3 MTT比色法測定細胞活力 取對數(shù)生長期細胞，以每孔2×105/mL接種于多聚賴氨酸包被的96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行孵育，24 h內(nèi)細胞達到80～90%融合后，用含體積分數(shù)0.01%FBS的DMEM孵育細胞24 h，使細胞同步化。將接種孔分為五組：空白對照組、H2O2損傷組（300 μmol/L）、Res低濃度（5 μmol/L）、中濃度（10 μmol/L）、高濃度（20 μmol/L）預(yù)處理 20 min 加H2O2損傷組。損傷組是在經(jīng)更換1%胎牛血清的培養(yǎng)液24 h后，加入終濃度為300 μmol/L H2O2繼續(xù)作用24 h，各保護組加入不同終濃度Res預(yù)處理1 h，再進行損傷組相同處理，正常對照組加入等量的培養(yǎng)液，每個濃度及對照組均設(shè)6個平行孔。孵育24 h后，每孔加入20 μL MTT（5 g/L），37 ℃孵育4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO進制150 μL，振蕩10 min后，用酶標儀于570 nm檢測每孔光密度值（OD）值，按公式：細胞存活率=OD570（模型組或Res干預(yù)組）/OD570（正常對照組）×100%計算細胞存活率。

1.4 MDA、LDH、SOD和 GSH 的測定 HUVECs接種、用藥處理步驟同1.3項。取上清細胞培養(yǎng)液，供LDH測定之用。以0.25%胰酶消化、收集 HUVECs，超聲波打碎細胞后，根據(jù)試劑盒說明書加入檢測試劑，用721分光光度計測定OD值，考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)量，以蛋白質(zhì)量分別較正計算MDA、LDH、SOD、GSH 量及活性。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 HUVECs接種、用藥處理步驟同1.3項。細胞用Res和H2O2處理后，以0.25%胰酶消化、收集HUVECs，70%冷乙醇固定過夜，棄去冷乙醇，用冷PBS洗2次，調(diào)整細胞密度為1×109/L，加終濃度1 mg/mL RNase A 200 μL，37 ℃ 孵育30 min，避光加終濃度20 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化吡啶染液，室溫避光放置30 min，立即用流式細胞儀檢測細凋亡細胞及死亡細胞數(shù)。

1.6 Western blot檢測caspase-3的表達 HUVECs接種、用藥處理步驟同1.3項。細胞用Res和H2O2處理后，用細胞刮刀刮下細胞，用冷PBS沖洗2遍，離心，棄去上清，在內(nèi)皮細胞中加入1 mL細胞裂解緩沖液［1%（v/v）NP-40，0.1%（m/v）SDS，0.5%（m/v）脫氧膽酸鈉，150 mmol/L NaCl和20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0］，其中含苯甲磺酰氟（PMSF，1 μmol/L）、蛋白抑制劑 cocktail和磷酸酶抑制劑cocktail，勻漿液在4℃以15 000 g離心20 min，取上清液即為蛋白提取液，－80℃保存?zhèn)溆?。取蛋白提取液，F(xiàn)olin-酚進行蛋白質(zhì)定量，取相當于15 μg蛋白量的蛋白提取液樣本上樣，然后按常規(guī)進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以含5%脫脂奶粉的TBS室溫下封閉2 h，在膜上加入兔抗caspase-3（1∶500），4℃下孵育過夜。棄一抗，以TBS洗滌3次，每次10 min。加入TBS稀釋的HRP-IgG二抗中 （1∶5 000），室溫孵育2 h。棄二抗，以TBS洗滌3次，每次10 min，加入 ECL發(fā)光劑，室溫下孵育5 min后用X線感光膠片曝光、顯影和定影。用凝膠成像分析系統(tǒng)對caspase-3蛋白條帶與相應(yīng)的內(nèi)參照β-actin條帶進行灰度掃描，以兩者掃描強度比值作為caspase-3蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)表示為均值±標準差，采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 Res對H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后細胞活力的影響

與正常對照組相比，H2O2損傷模型組細胞活力顯著降低 （P＜0.01），Res各劑量組與H2O2損傷模型組相比，細胞活力顯著升高 （P＜0.05或P＜0.01），且具有明顯的劑量依賴性。結(jié)果見圖1。與空白對照組比較：##P＜0.01；與 H2O2損傷模型組比較：*P＜0.05，＊＊P＜0.01

圖1 Res對H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后細胞活力的影響（±s，n=6）Fig.1 Effect of Res on the cell viability of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

2.2 Res對 H2O2誘導(dǎo) HUVECs損傷后 MDA和LDH量的影響

由表1可見，與空白對照組相比，H2O2損傷模型組MDA量和釋放LDH水平顯著升高（P＜0.01），Res各劑量組與H2O2損傷模型組相比，MDA量和釋放 LDH水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），呈明顯的劑量依賴性。

表1 Res對H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后MDA和LDH水平的影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of Res on the level of MDA and LDH of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

表1 Res對H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后MDA和LDH水平的影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of Res on the level of MDA and LDH of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

注：與空白對照組比較：##P＜0.01；與H2O2損傷模型組比較：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑量/（μmoL/L）MDA/（μmoL/mg prot）LDH/（U/L）空白對照組 － 3.93 ±0.85 0.382 ±0.064 H2O2損傷對照組 － 6.58±1.21## 0.676±0.058##Res低濃度組 5 5.74 ±0.98* 0.514 ±0.049*Res中濃度組 10 5.02 ±0.95＊＊ 0.462 ±0.014＊＊Res高濃度組 20 4.33 ±0.69＊＊ 0.405 ±0.024＊＊

2.3 Res對 H2O2誘導(dǎo) HUVECs損傷后 SOD和GSH活性的影響

由表2可見，與空白對照組相比，H2O2損傷模型組SOD和還原型GSH活性顯著降低 （P＜0.01），Res各劑量組與H2O2損傷模型組相比，SOD和GSH活性顯著升高 （P＜0.05或P＜0.01），呈明顯的劑量依賴性。

表2 Res對H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后SOD和GSH量的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of Res on the activity of SOD and GSH of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

表2 Res對H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后SOD和GSH量的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of Res on the activity of SOD and GSH of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與H2O2損傷模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑量/（μmoL/L）SOD/（U/mg prot）GSH/（U/mg prot）空白對照組 － 265.3 ±16.8 60.58 ±0.72 H2O2損傷對照組 － 128.8±9.26## 10.64±1.45##Res低濃度組 5 155.4 ±7.82* 16.52 ±1.08*Res中濃度組 10 185.2 ±10.5＊＊ 31.86 ±2.13＊＊Res高濃度組 20 228.3 ±12.7＊＊ 48.42 ±1.29＊＊

2.4 Res對H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后凋亡率的影響

圖2 Res對H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后細胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of Res on apoptosis of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide

由圖2和表3可見，與空白對照組相比，H2O2損傷模型組細胞凋亡率明顯增加 （P＜0.01），Res各劑量組與H2O2損傷模型組相比，細胞凋亡率顯著降低 （P＜0.05或P＜0.01），且隨著 Res劑量的增加凋亡率降低越明顯。

表3 Res對H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后細胞凋亡率的影響（±s，n=6）Tab.3 Effect of Res on the apoptosis rate of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

表3 Res對H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后細胞凋亡率的影響（±s，n=6）Tab.3 Effect of Res on the apoptosis rate of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與H2O2損傷模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑量/（μmoL/L） 凋亡率/%空白對照組6.52 ±1.45 H2O2損傷對照組 － 35.68±2.23##Res低濃度組 5 25.74 ±1.98*Res中濃度組 10 15.19 ±1.95＊＊Res高濃度組 20 9.56 ±1.69－＊＊

2.5 Res對 H2O2誘導(dǎo) HUVECs損傷后 caspase-3表達的影響

由圖3和表4可見，與空白對照組相比，H2O2損傷模型組caspase-3表達顯著增加（P＜0.01）；與H2O2損傷模型組相比，Res各劑量組caspase-3表達顯著降低 （P＜0.01），且隨著Res劑量的增加降低越明顯。

圖3 Res對H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后caspase-3表達的影響Fig.3 Effect of Res on expression of Caspase-3 of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide

表4 Res對H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后caspase-3表達的影響（±s，n=6）Tab.4 Effect of Res on expression of Caspase-3 of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

表4 Res對H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷后caspase-3表達的影響（±s，n=6）Tab.4 Effect of Res on expression of Caspase-3 of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與H2O2損傷模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑量/（μmoL/L） Caspase-3相對表達量空白對照組0.075 ±0.013 H2O2損傷對照組 － 0.352±0.083##Res低濃度組 5 0.211 ±0.098＊＊Res中濃度組 10 0.096 ±0.021＊＊Res高濃度組 20 0.076 ±0.014－＊＊

3 討論

前期研究表明，Res對缺血再灌注造成的腦損傷與心臟損傷均具有對抗和保護作用，且與抗炎作用和抗氧化作用相關(guān)［4-6］。但是Res對心腦血管疾病的防治作用是通過什么環(huán)節(jié)發(fā)揮的，尚未能闡明。本研究通過體外培養(yǎng)HUVECs，采用氧化性損傷誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡的方法初步探討Res對心腦血管損傷的保護作用機制。

血管內(nèi)皮細胞活力的強弱反映細胞增殖、代謝能力與血管機能狀態(tài)，而LDH反映細胞膜完整性和細胞損傷與死亡程度。結(jié)果表明，Res減少H2O2誘導(dǎo)的細胞線粒體損傷，增加細胞活力；H2O2損傷模型組細胞培養(yǎng)液中LDH漏出率明顯高于空白對照組，而給予Res后，細胞培養(yǎng)上清液中的LDH量明顯減少，提示Res可減輕H2O2所致的細胞膜損傷，從而對內(nèi)皮細胞產(chǎn)生保護作用。

氧化應(yīng)激在心腦血管疾病中起著關(guān)鍵作用，H2O2是活性氧之一，可在細胞外誘導(dǎo)細胞凋亡，同時促進羥自由基產(chǎn)生，誘導(dǎo)細胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞受損而死亡［8-9］，并繼發(fā)組織損傷，而體內(nèi)存在天然抗氧化系統(tǒng)SOD和還原型GSH對抗氧化應(yīng)激的細胞損傷作用。因此，凡抑制氧化應(yīng)激和/或提高抗氧化系統(tǒng)功能均可防止細胞損傷的發(fā)生。Res作為抗氧化劑，可以使MDA水平降低，SOD和GSH活性增加，提示Res可能是通過增強體內(nèi)抗氧化性應(yīng)激系統(tǒng)作用拮抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷作用的。

在氧化性應(yīng)激下激發(fā)產(chǎn)生的細胞凋亡是體內(nèi)外因素觸發(fā)細胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序?qū)е碌募毎劳鲞^程［10-11］，而在不同的細胞凋亡因素刺激下，細胞內(nèi)多個酶系統(tǒng)發(fā)生變化，其中caspase-3為最關(guān)鍵的酶之一，其位于凋亡的下游，一經(jīng)活化，凋亡就不可逆轉(zhuǎn)，如果抑制其活化，則可抑制凋亡的發(fā)生［12］。在細胞周期中，G0/G1期的細胞數(shù)量百分比減少，S期細胞數(shù)量百分比增加反映細胞內(nèi)DNA增殖，細胞活力較高，反之，如果G0/G1期細胞比例偏大，說明靜息或進入程序性死亡的細胞增多［13］。本實驗結(jié)果表明，Res預(yù)處理能使G0/G1期的細胞數(shù)量百分比減少，S期細胞數(shù)量百分比增加，凋亡率顯著降低，caspase-3表達降低，提示Res能使受損內(nèi)皮細胞減少，增殖活力提高，且與caspase-3表達相關(guān)。

近年來研究表明，血管內(nèi)皮細胞功能損害是心血管疾病早期的重要特征，是促發(fā)動脈粥樣硬化、血管順應(yīng)性改變、血管對縮血管性因素和擴血管性因素反應(yīng)改變的最重要始動因素［14-15］，而在這過程中，內(nèi)皮細胞凋亡的發(fā)生與內(nèi)皮細胞受損傷關(guān)鍵尤為密切，因此，如何防止內(nèi)皮細胞凋亡的發(fā)生，從而保護內(nèi)皮細胞完整性和功能正常是目前臨床醫(yī)藥工作者必須解決的重要課題，同時，尋找抗內(nèi)皮細胞凋亡和保護內(nèi)皮細胞功能的藥物也為防治心血管疾病提供了新的靶點。

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Protective effect of resveratrol on human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide

LIU Yong-gang1，LUO Jing-hui2*
（1.Department of Pharmacy，Guangdong Province Corps Hospital，Chinese People＇s Army Force，Guangzhou 510507，China；2.Pharmaceutical Department，Nanfang Hospital，Guangzhou 510515，China）

AIMTo investigate the protective effect of resveratrol（Res）on the injury of human umbilical vein endothelial cell（HUVECs）induced by hydrogen peroxide（H2O2）in vitroand to explore its mechanism.METHODSThe HUVECs was subculturedin vitroand used for experiment.They were divided into five groups as follows：control group，H2O2-injured group（300 μmoL/L），low-dosage of Res group（5 μmoL/L），mid-dosage of Res group（10 μmoL/L）and high-dosage of Res group（20 μmoL/L）.MTT was used to determine the HUVECs viability.The contents of malondialdehyde（MDA），lactate dehydrogenase（LDH），superoxide dismutase（SOD），reduced glutathion（GSH）were measured by the commercial kits.Apoptosis rate of the HUVECs was analyzed by flow cytometry.The expression of apoptosis-related protein caspase-3 was measured by western blot.RESULTSCompared with the control group，H2O2significantly decreased HUVECs viability，increased the contents of MDA，LDH，and decreased the contents of SOD and GSH，and meantime increased the apoptosis rate and caspase-3 expression in H2O2-injured group.CONCLUSIONRes can protect HUVECs from HUVECs from H2O2-induced injury through lowering the expression of caspase-3，and inhibiting the endothelial cel apoptosis.

resveratrol；oxidative stress injury；endothelial cell

R962

A

1001-1528（2011）07-1126-05

2010-07-30

劉永剛（1971—），男，副主任藥師，博士，從事中藥新藥研究與醫(yī)院藥學。Tel：（020）61627401，E-mail：liuyg1999@163.com

*通信作者：羅景慧（1971—），女，副主任藥師，博士，從事腎臟損傷防治新藥研究與開發(fā)。E-mail：yangyingluohui@hotmail.com