劉善云,何玉秀,張洪俠

(1.天津體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)系,天津 300381;2.河北師范大學(xué)體育學(xué)院,石家莊 050016;3.天津中醫(yī)藥大學(xué)臨床實(shí)訓(xùn)教學(xué)部,天津 300193)

動(dòng)脈壁內(nèi)皮損傷和中膜平滑肌細(xì)胞增生與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。各種致AS危險(xiǎn)因素使內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)受損及功能改變,促使血液中的脂質(zhì)進(jìn)入動(dòng)脈壁并沉積在內(nèi)膜下,引發(fā)中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移并大量增殖,最終促使AS斑塊的形成。目前認(rèn)為,內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是AS病變發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)[1]。因此,對動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用的各種干預(yù)手段在AS的防治中有著重要的意義。運(yùn)動(dòng)療法是AS綜合防治中的重要干預(yù)手段之一,在以往關(guān)于運(yùn)動(dòng)防治AS的研究中證實(shí),有氧運(yùn)動(dòng)通過改善血脂代謝以及控制致AS的危險(xiǎn)因素而發(fā)揮抗AS的作用[2]。但運(yùn)動(dòng)干預(yù)對動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)影響的病理學(xué)研究報(bào)道較少,尤其缺乏關(guān)于運(yùn)動(dòng)對已經(jīng)形成的AS的干預(yù)效果的相關(guān)報(bào)道。本研究在采用高脂飲食誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物AS的基礎(chǔ)上,深入觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物AS形成和病變進(jìn)程中主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的變化及耐力性運(yùn)動(dòng)對其影響的干預(yù)效果,為運(yùn)動(dòng)防治AS提供實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取48只8周齡C57BL/6J小鼠,雄性,體重16～20g。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組(n=12):正常對照組(N組)、12周高脂飲食致AS組(H組)、12周高脂飲食致AS后繼續(xù)10周高脂飲食并結(jié)合運(yùn)動(dòng)組(H+E組)、持續(xù)22周高脂飲食不運(yùn)動(dòng)組(HS組)。12 w實(shí)驗(yàn)組(H組)用于復(fù)制AS模型;22周實(shí)驗(yàn)組(H+E組、HS組)用于觀察運(yùn)動(dòng)對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已經(jīng)形成的AS的干預(yù)作用。

正常對照組(N組)飼以標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料,其他各組動(dòng)物均飼以高脂飼料。高脂飼料配方為:在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料中添加10%豬油、1.25%膽固醇、0.5%膽酸鈉。各組動(dòng)物均自由飲食、飲水。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

運(yùn)動(dòng)方式采用無負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng),H+E組于高脂膳食12周后進(jìn)行為期10周的耐力性運(yùn)動(dòng),每周5 d。第1周運(yùn)動(dòng)時(shí)間為30min,第2周為60min,從第3周開始為90min。水深40cm,水溫(30±1)℃。

1.3 取材及標(biāo)本制作

實(shí)驗(yàn)持續(xù)12周,將N組和H組小鼠處死,實(shí)驗(yàn)持續(xù)22周,將HS組和H+E組小鼠處死,并取血液和主動(dòng)脈等組織。運(yùn)動(dòng)組小鼠于最后1 d訓(xùn)練后,停止訓(xùn)練24h,禁食過夜。各組小鼠摘眼球取血后,選取主動(dòng)脈約1 cm,迅速剔除周圍組織并浸入生理鹽水中洗去血污,立即投入2.5%的戊二醛固定液中,經(jīng)1%四氧化鋨后固定、乙醇逐級脫水和 E-pon812環(huán)氧樹脂包埋后,采用LK B-V型超薄切片機(jī)(瑞典)制作超薄切片,切片厚度50nm,醋酸鈾及檸檬酸鹽染色,在JEOL-100CX型(日本)透射電鏡下觀察主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)及其病理變化。

2 結(jié)果

2.1 正常飲食小鼠主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)觀察

N組小鼠主動(dòng)脈超微病理學(xué)觀察顯示(2例,圖1):主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表面光滑,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)清晰,內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞內(nèi)均未見脂質(zhì)沉積和泡沫細(xì)胞等。結(jié)果提示,正常飲食的C57BL/6J小鼠主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)完全正常,未出現(xiàn)任何AS病變。

Fig.1 Utrastructure of aorta in N group mice

2.2 高脂飲食致AS小鼠主動(dòng)脈超微病理學(xué)觀察

H組小鼠主動(dòng)脈超微病理學(xué)觀察所見(4例,圖2):(1)內(nèi)皮細(xì)胞破裂、崩解,細(xì)胞殘屑及細(xì)胞內(nèi)容物釋出;內(nèi)皮下膠原大面積裸露,可見單核細(xì)胞及血小板向裸露的膠原處粘附;(2)單核細(xì)胞遷移至內(nèi)皮下,細(xì)胞內(nèi)可見大量脂質(zhì)形成單核細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞;(3)平滑肌細(xì)胞脂質(zhì)沉積嚴(yán)重,并穿過彈力膜向內(nèi)皮下遷移;(4)脫落變性的內(nèi)皮細(xì)胞與血小板、纖維素等聚集形成血栓。結(jié)果顯示,H組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重,平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)沉積及向內(nèi)皮下遷移等。將以上結(jié)果與正常對照組比較,提示在本實(shí)驗(yàn)中高脂飲食有明顯的致AS作用。

Fig.2 Ultrastructure of aorta in H group mice

2.3 持續(xù)22周高脂飲食小鼠主動(dòng)脈超微病理學(xué)觀察

HS組小鼠主動(dòng)脈超微病理學(xué)觀察所見(6例,圖3):(1)大部分內(nèi)皮細(xì)胞壞死,膜溶解,細(xì)胞器變性,形成大量碎片并脫落到血管腔中;內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有大量脂泡,內(nèi)皮下嚴(yán)重水腫;(2)可見大量壞死內(nèi)皮細(xì)胞脫落而暴露基底板和膠原纖維以及微血栓;(3)多數(shù)平滑肌細(xì)胞核呈不規(guī)則形,內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清晰,線粒體較小而暗,肌絲結(jié)構(gòu)模糊,胞質(zhì)內(nèi)可見大量脂泡;(4)極少數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷較輕,但有大量脂泡。結(jié)果提示,與H組比較,持續(xù)22 w高脂飲食(HS組)小鼠主動(dòng)脈病變加重,內(nèi)皮細(xì)胞的壞死、平滑肌細(xì)胞的損傷以及血栓的形成等都較其他各組嚴(yán)重。

Fig.3 Ultrastructure of aorta in HS group mice

2.4 高脂飲食致AS后繼續(xù)高脂飲食并結(jié)合耐力運(yùn)動(dòng)小鼠主動(dòng)脈超微病理學(xué)觀察

H+E組小鼠主動(dòng)脈超微病理學(xué)觀察所見(6例,圖4):(1)部分內(nèi)皮細(xì)胞表面膜溶解,細(xì)胞器暴露于血管腔,但損傷程度較 H組稍輕微,尚見部分內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、核及細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完好;(2)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉著較顯著,但未見明顯的壞死內(nèi)皮細(xì)胞脫落現(xiàn)象;(3)平滑肌細(xì)胞內(nèi)有大量脂泡,細(xì)胞周圍有水腫現(xiàn)象;(4)血管腔中有2/5例可見微血栓形成。結(jié)果提示,H+E組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的損傷較嚴(yán)重,脂質(zhì)浸潤較為普遍,但整體病變程度較H組有所改善,并較HS組明顯減輕。

Fig.4 Ultrastructure of aorta in H+E group mice

3 討論

3.1 高脂飲食誘發(fā)C57BL/6J小鼠AS的形成

脂質(zhì)代謝異常特別是膽固醇酯在動(dòng)脈壁沉積是誘發(fā)AS的重要起始因素。已有研究表明,應(yīng)用C57BL/6J小鼠可成功地復(fù)制食餌性AS模型[3-5]。楊小毅等對C57BL/6J小鼠飼喂2%膽固醇飲食16周后,血清脂質(zhì)(TC、TG)水平顯著升高,并與人類高脂血癥接近,形態(tài)學(xué)觀察顯示,在主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈處均有明顯斑塊形成,表明已成功地建立實(shí)驗(yàn)性AS純系小鼠整體動(dòng)物模型[5]。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物AS的發(fā)生,并應(yīng)用電鏡觀察主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)變化,結(jié)果顯示,與正常飲食對照組(N組)比較,高脂飲食導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生明顯AS病變,高脂飲食組(H組)各樣本中均可見多種AS病變,如:內(nèi)皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重,內(nèi)皮下纖維組織大面積裸露,平滑肌細(xì)胞遷移及形成豐富泡沫細(xì)胞等現(xiàn)象。提示內(nèi)皮細(xì)胞正常屏障功能及其抗粘附作用等已受到較為嚴(yán)重?fù)p傷。此外,血栓的形成表明病變已涉及體內(nèi)凝血、纖溶等多個(gè)系統(tǒng),是AS已發(fā)展至較為嚴(yán)重階段的另一重要標(biāo)志。結(jié)果表明,在本實(shí)驗(yàn)中,采用12周高脂飲食成功地誘發(fā)C57BL/6J小鼠AS發(fā)生。

AS“損傷反應(yīng)”學(xué)說認(rèn)為,內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。內(nèi)皮層是血液與組織之間的重要屏障,各種致AS的危險(xiǎn)因素(如長期高脂飲食)可使內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能改變,導(dǎo)致血管正常屏障功能受損,使血液中的脂質(zhì)和單核細(xì)胞等成分更易于侵入動(dòng)脈壁,并刺激平滑肌細(xì)胞增殖和向內(nèi)膜遷移,平滑肌細(xì)胞和吞噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)后進(jìn)一步成為泡沫細(xì)胞,最終促使AS斑塊的形成。表明內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損和功能改變與AS發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可促進(jìn)血管壁的脂質(zhì)沉積,并引發(fā)一系列復(fù)雜的連鎖反應(yīng)和惡性循環(huán)而促成AS的發(fā)生。

3.2 耐力性運(yùn)動(dòng)對C57BL/6J小鼠已經(jīng)形成的AS病變的干預(yù)作用

以往研究已表明,長期有氧運(yùn)動(dòng)能有效地抵抗或阻抑AS的形成,從而起到預(yù)防或延緩AS病變發(fā)生的作用[6-7],并證實(shí)運(yùn)動(dòng)通過改善主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)而發(fā)揮其抗AS的作用[8-9]。但目前關(guān)于運(yùn)動(dòng)對已經(jīng)形成的AS病變的治療或改善效果的研究報(bào)道甚少。陳近利等研究證實(shí),有氧運(yùn)動(dòng)和低脂膳食對Apo E基因敲除小鼠已經(jīng)形成的動(dòng)脈粥樣硬化具有減少AS斑塊的作用[10]。本實(shí)驗(yàn)在采用高脂飲食誘發(fā)C57BL/6J小鼠AS的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察了耐力運(yùn)動(dòng)對已形成AS的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)的干預(yù)作用及其病理發(fā)展變化的影響。結(jié)果顯示,持續(xù)22周高脂飲食(HS組)實(shí)驗(yàn)小鼠主動(dòng)脈病變程度較H組明顯加重,而實(shí)施10周運(yùn)動(dòng)干預(yù)的實(shí)驗(yàn)小鼠(H+E組)主動(dòng)脈整體病變程度較HS組輕微,并較H組有所改善。從 H組、HS組、H+E組等各組主動(dòng)脈電鏡觀察結(jié)果比較提示,耐力性運(yùn)動(dòng)延緩了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物AS的病變進(jìn)程,對于已經(jīng)形成的AS病變具有一定的改善作用。提示耐力性運(yùn)動(dòng)對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用在AS的預(yù)防和穩(wěn)定中有著十分重要的意義。

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