黃文姝,董愛(ài)軍,金紅雨,劉 心
鹽酸度洛西汀是對(duì)5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)的攝取有雙重抑制作用的化合物,目前研究表明,該藥對(duì)抑郁癥[1-2]、糖尿病性周?chē)窠?jīng)病引起的疼痛以及緊張性尿失禁等均有一定的療效。鹽酸度洛西汀在合成過(guò)程中可能帶進(jìn)原料、中間體、副產(chǎn)物,同時(shí)合成及放置過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生降解物質(zhì)[3]。為了更加有效地控制本品質(zhì)量,本文建立高效液相色譜法對(duì)鹽酸度洛西汀中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。
Waters高效液相色譜儀(600泵、2487紫外檢測(cè)器、996二極管陣列檢測(cè)器、Millennium32色譜工作站,美國(guó)Waters公司);鹽酸度洛西汀精制品(自制,純度99.9%),鹽酸度洛西汀(自制,批號(hào):20050201、20050202、20050203),中間體(自制);乙腈為色譜純,水為重蒸餾水,其他試劑均為分析純。
色譜柱:Inertsil CN-3(4.6 mm ×250 mm,5 μm),流動(dòng)相:0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用三乙胺調(diào)節(jié) pH 值為 6.0)-乙腈(30∶70)[4],流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm。柱溫:室溫,進(jìn)樣量:20 μL,理論板數(shù)按鹽酸度洛西汀計(jì)算,應(yīng)不低于2 000,鹽酸度洛西汀與相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5,實(shí)際測(cè)定時(shí),鹽酸度洛西汀與最鄰近的雜質(zhì)色譜峰分離度為2.8。
取本品適量,加流動(dòng)相溶解并制成每1 mL中約含40 μg的溶液,作為供試品溶液;精密量取供試品溶液適量,用流動(dòng)相稀釋制成每1 mL中約含0.4 μg的溶液,作為對(duì)照溶液。
4.1 檢測(cè)限 取鹽酸度洛西汀精制品適量,加流動(dòng)相使其溶解,并逐級(jí)稀釋?zhuān)?項(xiàng)下的色譜條件取20 μL進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算其信噪比S/N=3時(shí),檢測(cè)限為0.013 ng。
4.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)
4.2.1 主要原料與中間體的檢出 取本品、合成用主要原料及中間體適量,制成混合溶液,按2項(xiàng)下的色譜條件注入二極管陣列檢測(cè)器(PDA)液相色譜儀,記錄色譜圖,見(jiàn)圖1、圖2。幾個(gè)主要原料、中間體均能與鹽酸度洛西汀得到良好分離。
4.2.2 粗品的檢測(cè) 取本品粗品適量,加流動(dòng)相溶解后,按2項(xiàng)下的色譜條件注入液相色譜儀,見(jiàn)圖3。本品粗品中所含雜質(zhì)在此色譜條件下能夠得到檢出,并能與主成分得到良好分離。
4.2.3 降解試驗(yàn) 酸破壞試驗(yàn):取本品10 mg,用0.1 mol/L鹽酸溶液10 mL溶解,水浴加熱30 min后,用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性,再用 流動(dòng)相稀釋至250 mL。
圖1 鹽酸度洛西汀HPLC圖譜注:1.鹽酸度洛西汀
圖2 鹽酸度洛西汀、主要原料、中間體混合溶液HPLC圖譜注:1.中間體Ⅱ;2.原料Ⅱ;3.原料Ⅰ;4.中間體Ⅰ;5.鹽酸度洛西汀
圖3 鹽酸度洛西汀粗品HPLC圖譜注:1.鹽酸度洛西汀
堿破壞試驗(yàn):取本品10 mg,用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL溶解,水浴加熱30 min后,用0.1 mol/L鹽酸溶液中和至中性,再用流動(dòng)相稀釋至250 mL。
氧化破壞試驗(yàn):取本品10 mg,加入雙氧水溶液適量(約0.5 mL),水浴煮沸除去未反應(yīng)的雙氧水后,再用流動(dòng)相稀釋至250 mL。
光照破壞試驗(yàn):取本品適量,于4500LUX光強(qiáng)度下照射10 d后,用流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL中約含40 μg的溶液。
高溫破壞試驗(yàn):取本品,于60℃條件下放置10 d后,用流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL中約含40 μg 的溶液。
分別取上述溶液20 μL,按2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖4(因本品在光照及高溫條件下質(zhì)量穩(wěn)定,無(wú)降解物產(chǎn)生,故色譜圖未附)。本方法能夠有效檢測(cè)出各破壞試驗(yàn)中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物,且降解產(chǎn)物均能與主成分峰達(dá)到良好分離,表明本方法對(duì)降解產(chǎn)物檢查的專(zhuān)屬性較好。
圖4 鹽酸度洛西汀降解實(shí)驗(yàn)HPLC圖譜A.酸破壞;B.堿破壞;C.氧化破壞
4.2.4 峰純度檢查 為檢查樣品的HPLC色譜峰是單一成分還是多個(gè)成分,取上述樣品、主要原料及中間體的混合液,用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)主成分色譜峰的峰純度進(jìn)行檢查,結(jié)果純度因子大于閾值,主峰純度符合要求。
取3項(xiàng)下的對(duì)照溶液20 μL注入液相色譜儀,調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度,使主成分色譜峰高約為滿量程的20%,再精密量取供試品溶液20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰,各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積(1.0%)。測(cè)定精制品與 3批樣品(批號(hào):20050201、20050202、20050203)中有關(guān)物質(zhì)的含量分別為0.04% 、0.22% 、0.36% 、0.18% 。
6.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 經(jīng)多步反應(yīng)得到的終產(chǎn)品鹽酸度洛西汀,其主要原料、主要中間體和粗品等經(jīng)PDA檢測(cè)器檢測(cè),各種樣品的最大吸收波長(zhǎng)均在228 nm左右,因此,選擇228 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng),以有利于雜質(zhì)的檢出。
6.2 流動(dòng)相的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道有采用磷酸二氫鉀緩沖液、乙腈或甲醇等做流動(dòng)相,梯度洗脫的方式,雖然能夠有效檢出各種雜質(zhì),但不適合快速檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上對(duì)流動(dòng)相的有機(jī)溶劑進(jìn)行選擇,考察了甲醇和乙腈兩種溶劑,結(jié)果表明,乙腈分離效果較好。
6.3 色譜柱的選擇 筆者曾對(duì)C18柱及氰基柱分別進(jìn)行了考察,結(jié)果表明,氰基柱的分離效果要優(yōu)于C18柱,因此,選擇氰基柱作為本品有關(guān)物質(zhì)檢查用色譜柱。
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